オーラノフィン

Scientific Reports volume 6、記事番号: 19525 (2016) この記事を引用

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6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

薬物を担持したナノ粒子 (NP) は、治療範囲内の適切な場所での薬物濃度を確保することで、感染症治療を改善できます。ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体) (PLGA) NP は、標的部位への薬物の局在化を強化し、捕捉された分子を持続的に放出することができ、抗生物質の全身投与によって引き起こされる二次効果を軽減します。我々は、関節リウマチの治療に伝統的に使用されている金化合物であるオーラノフィンをPLGA NPにロードし、2つのグラム陽性病原体、肺炎球菌と化膿連鎖球菌に対する抗菌剤としての有効性を評価しました。オーラノフィン PLGA NP は、0.25 μM のオーラノフィン NP で 6 時間処理した後、多剤耐性肺炎球菌株の培養物が実質的に滅菌されるため、強力な殺菌効果を示しました。さらに、この強力な殺菌効果は、肺炎連鎖球菌および化膿連鎖球菌バイオフィルムでも観察され、同じ濃度のオーラノフィン-NP が遊離オーラノフィンよりも約 4 log 多く細菌数を減少させることができました。これらの結果は、ゼブラフィッシュ胚モデルを使用して検証され、NPにロードされたオーラノフィンによる治療が肺炎球菌感染症に対して顕著な生存率を達成したことを実証しました。これらすべてのアプローチは、薬剤の自由投与と比較して、ロードされたオーラノフィン PLGA ナノキャリアの明らかな優位性を示し、これは連鎖球菌感染症の治療への応用の可能性を裏付けています。

細菌感染は臨床現場における重大な罹患率と死亡率の原因となっており、世界的な健康上の脅威と医療システムへの負担となっています1。肺炎球菌である肺炎球菌はグラム陽性病原体であり、幼児、高齢者、慢性疾患のある人における中耳炎、菌血症、髄膜炎などの病気の主な原因となっています。その臨床的負担は、侵襲性疾患（血液や脳脊髄液などの通常は無菌の部位からの肺炎球菌の分離として定義される）による年間約200万人の死亡であり、その半数は5歳未満の小児であるが、原因となる可能性が高い。非菌血性肺炎やその他の呼吸器疾患によるものはさらに多くあります2。したがって、成人の菌血症性肺炎球菌性肺炎の症例ごとに、非菌血症性肺炎球菌性肺炎の症例がさらに少なくとも 3 例存在すると推定されています3。肺炎球菌感染症と戦うための古典的な治療法は抗生物質の使用でしたが、この治療法の有効性は、主要な薬剤クラスに対する耐性の漸進的な選択によって損なわれており、治療の失敗が広く報告されています4,5。さらに、肺炎球菌分離株の数は少ないものの増加しており、複数の抗生物質に耐性があり、バンコマイシンが最後の選択薬となっています6。化膿レンサ球菌も重要なヒト病原体であり、咽頭炎患者から最も頻繁に分離される細菌ですが、壊死性筋膜炎、敗血症、トキシックショック症候群などのより重度の侵襲性感染症を引き起こします。連鎖球菌性咽頭炎の場合、主にバイオフィルム形成が原因で抗生物質治療が失敗したことが報告されています7。その結果、最近の報告書の中で、米国疾病管理予防センター（CDC）は、薬剤耐性病原体の蔓延を阻止するための積極的かつ即時の行動を求めています8。

現在、創薬と開発は非常に費用と時間がかかり、リスクの高いプロセスであることは周知の事実です。いわゆる薬物の「転用」（または「再プロファイリング」）は、この創薬プロセスをスピードアップする代替の有望な戦略であり、同時に失敗率と関連コストも削減されます9,10。この意味で、オーラノフィンは、1985 年に米国食品医薬品局 (FDA) によって承認された混合リガンド金化合物であり、Ridaura というブランド名で商品化され、重度の関節リウマチの治療に推奨されています 11。数年前、抗癌作用、抗ウイルス作用、および熱帯熱マラリア原虫、赤熱虫、ランブル鞭毛虫などの病原性原虫に対する作用を含む、オーラノフィンの新たな魅力的な薬学的活性が明らかになりました 12,13。オーラノフィンの抗菌活性はあまり研究されていませんが、クロストリジウム・ディフィシル14、黄色ブドウ球菌15、結核菌16などの特定のグラム陽性病原体に対する有望な効果が近年報告されています。

微生物耐性を克服するための最も成功した戦略の 1 つは、薬物送達システムとしてナノ粒子 (NP) を使用することです。ナノ粒子 (NP) は、人体において予測可能で望ましい治療効果を達成できるためです 17。この効果は、関連部位での薬物血漿濃度が治療域内にある場合、つまり毒性レベルより低いが有効レベルより高い場合に達成されます。したがって、NP からの抗生物質の持続放出により、治療効果が向上する可能性があります。さらに、NP は抗菌剤を感染部位に標的化するために使用されており、感染部位に高用量の薬剤を投与できるため、有害な副作用を軽減しながら殺菌活性を高めることができます 18。ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体) (PLGA) は、加水分解後に生成されるモノマーである乳酸とグリコール酸が内因性であり、体内で効率的に代謝されるため、生分解性ポリマーの使用に最も成功しているものの 1 つです。実際、NP の生産のために確立されている考えられるすべての生体材料の中で、PLGA はその魅力的な特性によりドラッグデリバリーコミュニティの関心を集めています。その中で、次の点に言及する価値があります。 a) 生分解性と生体適合性。 b) 薬物分子を生分解から保護する能力。 c) 持続放出システムの開発の可能性19、20、21。 PLGA NP は、ワクチン送達 22、がん治療 23、炎症性疾患の治療 24、25、再生医療 26、27、さらには一部の心血管疾患の治療にも使用されています 28。感染症の治療に関しては、特定の細菌感染症の治療を改善するための抗生物質-PLGA NPの開発を目的とした初期研究がいくつかあります。リファンピシンとアジスロマイシン 29、ゲンタマイシン 30、31、32、ナフシリン 33、スパルフロキサシン 34 など、さまざまな抗生物質が PLGA NP にカプセル化されています。いくつかの前臨床評価の後、PLGA NP は 2 つの原理に基づいてその抗感染力の可能性を実証しました。1 つは NP が通常エンドサイトーシスによって取り込まれるため、抗生物質と PLGA NP は細胞内感染を標的とする有望な送達システムです。また、NP は徐放性を達成できるため、抗生物質 PLGA NP は感染症の治療または予防に使用できます。

この研究では、概念実証として、2 つの重要な連鎖球菌病原体、すなわち S. pneumoniae および S. pyogenes に対する抗菌剤としての有効性を実証するために、オーラノフィンを担持した PLGA NP の使用を検討しました。多耐性肺炎球菌株と肺炎球菌および化膿連鎖球菌のバイオフィルムモデルを用いたインビトロアッセイ、およびゼブラフィッシュ胚感染モデルを用いたインビボで有望な結果が得られています。

PLGA NP（非担持およびオーラノフィン担持の両方）は、「方法」セクションで説明したナノ沈殿法に従って生成されました。消化実験で確認されたように、オーラノフィンは PLGA ナノキャリアへのロードに成功しました。 NPの形態は走査型電子顕微鏡（SEM）によって観察され（図1a）、生成されたNPの予想される球形の形状が示されました。ナノ沈殿段階でのオーラノフィンの装填は、粒子の形態に影響を与えませんでした (データは示されていません)。

オーラノフィンおよびPLGA NP。

（a）アンロードされたPLGA NPのSEM顕微鏡写真およびDLSによって測定されたPLGA NPのサイズ分布（挿入図）。 (b) PLGA NP からのオーラノフィンの in vitro 放出およびほぼゼロ次数に従った放出速度論の速度論的フィッティング (破線)。パネルには化学構造式のオーラノフィンが挿入されています。 Ac、アセチル。エート、エチル。

NP のサイズは、動的光散乱 (DLS) 装置を使用して評価されました。未装填されたNPとオーラノフィン-PLGA NPの両方の平均直径は約1.5μmであることが観察された。どちらの場合も 60 nm (図 1a)。表面特性はゼータ電位によって検査され、すべての NP は約 100 μm の値で負に帯電していました。予想通り、-30 mV。

使用したポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の比とその分子量は、実験の最初の 6 時間でオーラノフィンの一定の放出が達成されるように、放出速度を制御する特定の分解パターンに従うように選択されました。 PLGA NP からの放出動態は主に、水の存在下でのエステル結合の加水分解による PLGA 分解に基づいています。その場合、PLGA NP からの典型的な放出プロファイルはゼロ次相で構成されている必要があります。ただし、表面拡散、バルク拡散、ポリマー分子量の変化、NP の浸食など、放出速度に影響を与える他の効果もあります。それらはすべて、個別の方程式で再現するのが非常に難しい複雑なプロセスに寄与します。私たちの特別なケースでは、図1bに示されているオーラノフィン放出データは、次の方程式に従うゼロ次に近い反応速度モデルに当てはめることができます。

Qt は時間 t で放出されたオーラノフィンのパーセンテージ、Q0 は溶液中のオーラノフィンの初期量 (通常は Q0 = 0)、k は放出定数、n は純粋なゼロ次放出 (ポリマーの分解) で 1 となる係数です。マトリックス）、樋口型放出（薬物分子の拡散）では 0.5。

図1bに示す速度論的フィッティングのパラメータは、私たちの放出プロセスが純粋なゼロ放出（分解）でも純粋なヒグチ放出（拡散）でもなく、その中間（n = 0.81）、つまりほぼゼロ放出であることを示しています。ゼロ次キネティックリリース。

オーラノフィン単独またはオーラノフィンを担持したNPの殺菌活性を比較するために、我々は最初に非莢膜菌株S. pneumoniae R6を選択した。肺炎球菌株は、増殖の定常期の数時間後に自己分解を示すことに注意することが重要です。したがって、試験条件におけるオーラノフィンの放出動態と細菌の自己分解を考慮してインキュベーション時間を調整しました。化合物を、ＯＤ５５０が０．６の３つの異なる濃度（０．１、０．２５および０．５μＭ）で細菌懸濁液に添加し、増殖曲線全体にわたって細胞の光学密度を追跡した。生細胞計数により、0.5μMで6時間インキュベートすると細菌数が約3対数単位減少したため（図2a）、オーラノフィン単独が抗肺炎球菌薬として有効であることが実証されましたが、オーラノフィンNPで処理した培養物は、0.5μMの濃度で実質的に滅菌されました。 0.25 または 0.5 μM (図 2b)。その後、カプセル化された肺炎球菌分離株、すなわち株 D39、48、および 69 を使用して、オーラノフィンをロードした NP の殺菌活性もテストされました (表 1)。以前のアッセイと同様に、遊離オーラノフィンは、0.5μMで多耐性48株の生存率のほぼ3対数の減少を引き起こしました（図2c）が、オーラノフィンNPは0.25μMでも培養物の完全な死滅を引き起こしました（図2c）。 2d）。同等の結果が、D39 株 (血清型 2) および多剤耐性 69 株 (血清型 19F) で得られました (表 2)。殺菌効果がNP自体からではなくNPから放出されるオーラノフィンによってもたらされたことを確認するために、すべての実験で負荷されていないPLGA NPが常にテストされ、ナノキャリアが細菌集団を変化させないことが実証されました。

肺炎球菌株に対するオーラノフィンおよびオーラノフィン-PLGA NPの殺菌効果。

R6株(a、b)および48株(c、d)の指数関数的に増殖する培養物を、オーラノフィン単独(a、c)またはオーラノフィンNP(b、d)の非存在下または存在下でインキュベートした。オーラノフィンを含まない PBS バッファー、DMSO または PLGA を含むコントロールが含まれていました。生細胞は、37℃で6時間インキュベートした後、血液寒天プレート上で測定されました。データは 4 つの独立した実験の平均値です。エラーバーは標準偏差を表し、アスタリスクは、結果がオーラノフィンの非存在下での対照と比較して統計的に有意であることを示します(事後ダンネット検定による一元配置分散分析; * P < 0.01; ** P < 0.001)。

次に、我々は、化膿連鎖球菌の2つの株、タイプ株とSF370（後者は典型的なバイオフィルム形成株である）に対する、単独またはNPにロードされたオーラノフィンの有効性をテストした。表 2 に示すように、これらの菌株の殺菌効果は、肺炎球菌株に対して認められた殺菌効果と同じレベルには達しませんでした。実際、遊離オーラノフィンは、試験した最大濃度（0.5 μM）でも化膿連鎖球菌型株の生存に影響を与えませんでしたが、SF370 株の生存率の 90% 低下を引き起こしました。ただし、注目に値するのは、オーラノフィン NP が両方の化膿連鎖球菌株を効果的に殺し、タイプ株と SF370 株でそれぞれ 1 対数と 2 対数減少し、NP にロードされたときのオーラノフィンの効率の増加が確認されたことです。オーラノフィン単独との比較。

PLGA NP に充填されたオーラノフィンの連鎖球菌病原体に対する有効性がより優れていることを説明する理由の 1 つは、カプセル化された薬物の安定性が向上し、したがって急速な酵素分解および/または加水分解からの保護にある可能性があります 26。この問題を調査するために、オーラノフィン NP から起こる徐放をシミュレートするために 1 時間ごとにオーラノフィンパルスを追加して、肺炎球菌 R6 に対する殺菌アッセイを実行しました。 6パルスでオーラノフィンの最終濃度を0.5μMに調整すると、6時間の処理後に細菌数が6対数減少しましたが、実験の開始時に一度に添加された同じ濃度のオーラノフィンでは、生存率がほぼ4対数低下しました（図1）。 3)。これらの結果は、オーラノフィンの反復投与による治療が、高単回投与よりも肺炎球菌感染症に対してより効果的である可能性があることを強く示唆しています。言い換えれば、PLGA NPにオーラノフィンをカプセル化すると、薬剤の持続放出により治療効率が高まるため、優れた送達システムが可能になります。

肺炎球菌R6に対するオーラノフィンパルスの殺菌効果。

指数関数的に増殖する培養物を、3 つの異なる条件で添加した最終濃度 0.5 μM のオーラノフィンの存在下でインキュベートしました: 実験開始時の単回投与 (オーラノフィン)、6 時間の 1 時間パルス (オーラノフィンパルス)、またはPLGA NP（オーラノフィン-PLGA NP）にロードされます。オーラノフィンを含まない PBS バッファー、DMSO または PLGA を含むコントロールも含まれていました。生細胞は、37℃で6時間インキュベートした後、血液寒天プレート上で測定されました。データは 3 つの独立した実験の平均値です。エラーバーは標準偏差を表し、アスタリスクは、結果がオーラノフィンの非存在下での対照と比較して統計的に有意であることを示します(事後ダンネット検定による一元配置分散分析; * P < 0.01; ** P < 0.001)。

NP 中の遊離オーラノフィンおよびオーラノフィン負荷を、0.25、0.5、および 1 μM の濃度で肺炎連鎖球菌 P046 株に対して最初にアッセイしました。このバイオフィルムが発生しやすい株は、LytA および LytC 自己溶解素が欠損しているため、30 °C または 37 °C で長期間インキュベートしても自己消化しません。細菌のバイオフィルムに対する薬物のプラスの効果は、細胞の分散によるバイオフィルム形成の減少によって、そして最も重要なことに、残りの細胞に対する薬物の致死作用によって証明されます。その結果、対応する処理の6時間後にP046バイオフィルムに対する殺菌効果がチェックされ、その結果は、NPに充填された薬剤が遊離のオーラノフィンよりも効率的に肺炎連鎖球菌バイオフィルムで成長した細胞を死滅させることを明確に示した。例えば、オーラノフィン NP は 0.25 μM で約 4 log の細菌集団を死滅させました (99.9% 以上の死亡率)。一方、オーラノフィン単独では同じ濃度では実質的に効果がなく、90% の死亡率を達成するには少なくとも 1 μM の化合物が必要でした (図4a)。さらに、バイオフィルムとして増殖させた化膿連鎖球菌 SF370 株に対して、以前に使用したのと同じ濃度で同じ処理を確認しました。この場合の結果は、0.25μMの濃度のオーラノフィンNPが同じ4対数の細菌細胞を死滅させることができたため、前の実験と非常に似ていました。両病原体、肺炎連鎖球菌と化膿連鎖球菌の浮遊培養物とバイオフィルム成長培養物を比較した場合、遊離オーラノフィンとカプセル化オーラノフィンの間で致死活性が劇的に異なる挙動を示すことは注目に値する。図4および表2に示すように、遊離オーラノフィンは化膿連鎖球菌SF370株のバイオフィルム細胞よりも浮遊菌に対して高い殺菌効果を示した（0.5μMでそれぞれ約1および0.5log減少）。対照的に、オーラノフィンをロードしたPLGA NPは、浮遊増殖させた同じ細胞よりも両方の細菌のバイオフィルムに対して明らかに致死性が高かった（化膿連鎖球菌の場合、0.5μMでそれぞれ>4および2log減少）。

オーラノフィンまたはオーラノフィン-PLGA NPで処理された連鎖球菌バイオフィルム。

（ a ）バイオフィルムとして増殖させたS. pneumoniae P046株の細胞を、0.25、0.5および1μMのオーラノフィンおよびオーラノフィン-PLGA NPで37℃で6時間処理しました。（ b ）バイオフィルムとして増殖させた化膿連鎖球菌SF370株の細胞を、0.25、0.5および1μMのオーラノフィンおよびオーラノフィン-PLGA NPで37℃で6時間処理しました。対照には、PBS緩衝液、DMSOまたはPLGA NP中で6時間インキュベートしたバイオフィルムが含まれていました。生細胞を血液寒天プレート上で測定した。データは 3 回の独立した実験の平均を表します。エラーバーは標準偏差を表し、アスタリスクは、結果がオーラノフィンの非存在下での対照と比較して統計的に有意であることを示します(事後ダンネット検定による一元配置分散分析; * P < 0.01; ** P < 0.001)。

バイオフィルムとして増殖する 2 つの連鎖球菌に対するオーラノフィン NP の強力な殺傷効果が実証された後、この細菌の増殖を特徴づける典型的なメッシュの微細構造を共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で分析し、その活性による細胞分散能力を検出しました。オーラノフィンNPの。この分析は、P046肺炎球菌株とPBS中のバイオフィルムのCLSM画像に対して行われ、負荷されていないPLGA NPを含む対照に対応するものは、同様の細胞密度と生存細菌の割合を示しました（図5a、b）。対照的に、オーラノフィン-NPで処理したバイオフィルムは、残存する肺炎球菌細胞の大幅な損失を証明し（図5c）、PLGA NPにロードされたときのオーラノフィンの致死作用が完全に確認されました。

オーラノフィン-PLGA NPで処理した肺炎球菌バイオフィルムのCLSM。

バイオフィルムとして増殖させた肺炎連鎖球菌 P046 株の細胞を、PBS (a) または 1 μM の PLGA NP (b) とインキュベートするか、1 μM のオーラノフィン-PLGA NP (c) で 37 °C で 6 時間処理しました。その後、バイオフィルム内の細胞を BacLight LIVE/DEAD キットで染色し、生存細菌 (緑色蛍光) と非生存細菌 (赤色蛍光) を明らかにしました。水平方向の 3 次元再構成 (x–y 平面) が表示されます。バー、25μm。

感染の動物モデルでオーラノフィン NP の in vitro 殺菌結果を検証するために、我々は最近肺炎連鎖球菌および化膿連鎖球菌用に設定されたゼブラフィッシュ胚モデルを採用しました 35。肺炎球菌株 D39 を用いた対照実験では、E3 培地に浸漬して投与した場合、約 2.5 × 108 CFU mL-1 の細菌攻撃により 4 ～ 5 日で胚の 50% が死滅することが示されました。したがって、受精後 48 時間で、ゼブラフィッシュの胚を病原体と接触させました。細菌攻撃の8時間後、胚を同じ培地で徹底的に洗浄し、胚当たり0.1～0.5μMの範囲の濃度の遊離オーラノフィンまたはオーラノフィンNPの単回用量で処理した。熱死滅させた（65℃で10分間）D39株細胞を陰性対照として使用した。感染し、オーラノフィン NP で処理した胚の救出は、使用した濃度に応じて変化しました。つまり、0.5 μM で処理した場合は 100% 生存 (46/46)、0.25 μM で処理した場合は 93.5% (43/46)、および 89.1% (41/46) 46) 0.1 μM。これらの結果は、肺炎球菌感染から胚を保護するオーラノフィンの有効性を示し、また、オーラノフィン-NPでの処理が薬剤単独よりも約15%高い保護(P < 0.01)、例えば胚の73.9%(34/46)をもたらしたことを示した。両方とも同じ濃度（0.1μM）の遊離オーラノフィンで処理した場合、89.1％が生存し、オーラノフィンNPで処理した場合は89.1％が生存した（図6）。胚救出におけるオーラノフィンの有効性が、β-ラクタム系に属するアンピシリンのような従来の抗生物質の有効性と比較されました。両方の薬剤を単独で0.5μMで添加した場合、感染後5日後のゼブラフィッシュ胚の生存率はほぼ同じでした（84.6％）（図6a）。しかし、PLGA NPに負荷された同じ濃度のアンピシリンによる処理は、同様の割合（38/46、つまり82.6％）の胚を救出したのに対し、オーラノフィンNPは同じ濃度の0.5μMで生存率100％を達成しました（図6b）。。オーラノフィン NP の保護効果を視覚化するために、すべての実験グループの胚の形態学的変化を経時的に監視しました。実体顕微鏡を使用して胚を検査したところ、肺炎球菌D39に感染した胚は、対応する非感染対照と比較して、はるかに短く湾曲した尾と、主に心膜腔と卵黄嚢にいくつかの変形があることが判明した（図7b）。 7a)。しかし、感染し、0.5μMのオーラノフィンNPで処理された胚は完全に保護され、肺炎球菌感染によって引き起こされる典型的な変形は示されませんでした（図7c）。

オーラノフィンまたはオーラノフィン-PLGA NPによる肺炎球菌感染からのゼブラフィッシュ胚の救出。

肺炎連鎖球菌 D39 株に感染し、さまざまな濃度のオーラノフィンまたはオーラノフィン-PLGA NP で処理された (またはされなかった) 胚の生存を示します (条件あたり n= 24 ～ 36 個の胚)。 DMSO、オーラノフィン、アンピシリンのみを含むコントロールおよびPLGA NPにロードされたコントロールも含まれていました。胚の生存を 5 日間モニタリングし、結果をカプランマイヤー生存曲線としてプロットしました。生存曲線はログランク検定 (マンテル-コックス) およびゲーハン-ブレスロー-ウィルコクソン検定と比較されました (*P < 0.01; **P < 0.001)。

肺炎球菌に感染し、オーラノフィン-PLGA NPで処理したゼブラフィッシュ胚の顕微鏡画像。

(a) 未感染の胚グループ。 (b) 無処理の肺炎連鎖球菌 D39 株に感染した胚グループ。 (c) 感染し、0.5 μM オーラノフィン-PLGA NP で処理された胚グループ。画像は感染後 5 日後に撮影されました。略語: pe、心膜浮腫。 tm: 尾部奇形とyse、卵黄嚢浮腫。バー、500 μm。

多剤耐性菌によって引き起こされる感染症は、しばしば致死的な病態を促進するため、世界の健康の観点から重要な懸念事項となっています。高濃度の抗生物質で処理した後、たとえ死んだ細菌細胞が表面を覆っていたとしても、ほとんどの細菌がそのようなバイオフィルム内で生き残ったため、バイオフィルム由来の感染症との特別な関連性が明らかになりつつある7。病気の治療は、主に有効な抗生物質の不足により妨げられてきました。したがって、新しい作用機序を持つ新薬の同定は国際的な優先事項となっている 36,37。オーラノフィンは、チオ糖とトリエチルホスフィン残基に金(I)中心が配位した薬剤で、最近、病原性原虫12,13だけでなく、いくつかのグラム陽性菌やグラム陰性菌に対しても効果的な薬剤として再利用されています。後者のグループは前者よりも薬物に対する感受性が低かった。実際、最も感受性の高い検査対象のグラム陽性菌の MIC 値は 0.12 ～ 0.5 μg mL-1 の範囲でしたが、肺炎桿菌、緑膿菌、アシネトバクターなどの一部のグラム陰性菌では、これらの MIC は >16 μg mL-1 に増加しました。バウマニ15,16。オーラノフィンの殺菌効果の詳細なメカニズムは解明されていませんが、最近のデータは、チオール酸化還元恒常性が結核菌の細菌の標的であることを強く示唆しています 16。オーラノフィンは、多くのグラム陽性細菌においてチオール酸化還元バランスを維持し、反応性酸化種から保護するための重要なタンパク質である細菌チオレドキシン還元酵素を阻害することが実証されました15。

当初、我々はこの研究を、臨床的に関連する2つの病原体、S. pneumoniaeとS. pyogenesに対するオーラノフィンの殺菌効果に焦点を当てました。生存率データの要約を表 2 に示しますが、この薬剤は多耐性菌を含む、試験したすべての肺炎球菌株に対して強力な殺菌効果がある一方、検定した化膿連鎖球菌株に対してはかなり効果が低いことが実証されました。肺炎球菌の致死濃度の値 0.5 μM は 0.34 μg mL-1 に相当し、黄色ブドウ球菌や表皮連鎖球菌などの他のグラム陽性菌について報告されている MIC 値の範囲内です 16,38。肺炎球菌に対する再プロファイリングされたオーラノフィンによるこれらの有望な結果を受けて、細菌集団が抗生物質療法に対してより耐性または耐性があるバイオフィルムアッセイにおいても、薬剤の溶菌作用を改善および拡張する方法を探しました。活性化合物の製剤においてこの目標を達成するための典型的な解決策は、適切なビヒクルまたは NP に目的の薬物を充填することです。

ポリマーは製薬業界で 40 年以上使用されており、吸収性縫合糸や整形外科用インプラントから、治療薬の標的化と制御放出が可能な多機能 NP へと進化してきました。この意味で、より安全でより効果的な医薬品、いわゆるナノメディシンを開発するためのポリマーNPの使用は、製薬産業とバイオテクノロジー産業に大きな影響を与えています。とりわけ、生分解性PLGA NPは、その信頼性の高い調製方法、生体適合性（FDA承認）、生分解性39,40、薬物をカプセル化して分解から保護する能力21,41のおかげで、さまざまな生物学的用途に広く使用されています。さらに、活性分子を送達システム内に閉じ込める（またはカプセル化する）ことにより、所望の薬物の薬物動態学的挙動をより適切に制御できるようになります。医薬化合物のこのより効率的な使用は、いくつかの欠点を軽減し、古典的な治療に必要な現在の時間を短縮するための基礎を提供する可能性があります。これは、今日の感染症の治療における主要な懸念事項の 1 つである抗生物質に対する細菌の耐性を回避するのに役立つ可能性があるため、抗生物質を扱う際に非常に重要である可能性があります。文献には、PLGA NP への抗生物質のカプセル化によりその効率が向上する例が数多くあります。例えば、アジスロマイシンを負荷したPLGA NPは、チフス菌42に対してアジスロマイシン溶液よりも活性が高かった。最近では、クラリスロマイシン-PLGA NP が未処理のクラリスロマイシンよりも大腸菌、インフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌に対して効果的であることが報告されています43。 PLGA NP によって示された利点を考慮し、この送達システムにロードされた場合の抗生物質の有効性の向上を考慮して、100 nm 未満の直径と低い多分散指数を示す NP の再現可能な形成を可能にするプロトコルでオーラノフィン-PLGA NP を調製しました。均一なサイズ分布を示します。

PLGA NP からのオーラノフィンの装填と持続放出が確認されたら、感染症治療に対するそれらの潜在的な利点を評価しました。具体的には、オーラノフィン-PLGA の調製により、モデル系として 3 種類の実験を使用して、肺炎球菌および化膿連鎖球菌に対する致死活性をオーラノフィン単独の致死活性と比較することができました。 i) 関連する多耐性株を含むいくつかの肺炎球菌株を使用した in vitro 研究; ii) 肺炎連鎖球菌 P046 や化膿連鎖球菌 SF370 などの適切な菌株に対するバイオフィルムアッセイ。 iii) 肺炎連鎖球菌に感染したゼブラフィッシュ胚のような生体内動物モデル。これらすべてのアプローチは、PLGAにロードされたオーラノフィンの肺炎連鎖球菌および化膿連鎖球菌バイオフィルムの細菌集団を分散および殺傷する効力が約4を超えたため、特にバイオフィルムアプローチに重点を置いて、遊離オーラノフィンよりも改善されたオーラノフィン-NPの殺傷活性を確認した。両方の病原体に対して薬剤単独で見つかった致死率を記録します。この有望な結果は、古典的な抗生物質に対して特に抵抗力のあるバイオフィルムベースの感染症の将来の治療を予見する上で特に関連性がある可能性がある44。この種の NP の臨床応用を期待する追加の議論は、感染したゼブラフィッシュ胚を保護する in vitro アッセイの検証に成功したことからもたらされており、これは連鎖球菌感染症と戦うための薬物送達システムとしての NP の利点を強調しています。

オーラノフィンでカプセル化された PLGA NP を形成するためのナノ沈降法は、以前に記載された手順に従って実行されました 45。簡単に説明すると、10〜15 mgのオーラノフィン[Sigma-Aldrich、>98%高速液体クロマトグラフィー(HPLC)]を20 mLのジクロロメタン:アセトン(0.5:19.5)の混合物に溶解し、次に200 mgのPLGA(Aldrich、 50:50、Mw 7,000～17,000）を加え、続いて 2 分間超音波処理しました（溶液 1）。別に、５６ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８（Ｓｉｇｍａ）を、適度な磁気撹拌下、１００ｍＬ丸底フラスコ中で４０ｍＬの水（０．１４％ｗｖ−１）に溶解した（溶液２）。溶液１をシリンジディスペンサー上に置き、穏やかな磁気撹拌下で溶液２上に滴下（０．２５ｍＬ／分）して移した。 NPを2時間撹拌し、残りの有機溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下で2時間除去した。次に、NP を 7700 RCF ローター中、4 °C で 6,600 rpm で 15 分間遠心分離し、蒸留水で 2 回洗浄し、再度遠心分離しました。次に、NP を少量の水に懸濁し、液体窒素中で急速冷凍し、凍結乾燥しました。アンロードされたPLGA NPの合成については、オーラノフィンを使用せずに同じプロセスに従った。

生成された NP の球状形態は、JEOL JSM 6335F (電子顕微鏡センター、UCM) の SEM を使用して評価されました。サンプルは観察前に Au メタライゼーションを受けました。

平均流体力学的サイズと多分散指数は、633 nm レーザーを備えた DLS 装置 (Zetasizer NanoZS、Malvern Instruments) を使用して 25 °C で測定しました。超純水で調製した懸濁液からのサンプル (約 0.1 mg mL-1) を測定セルに入れた。

オーラノフィンは、誘導結合プラズマ原子発光分光法 (ICP-AES、Varian Vista AX Pro) により、267.6 nm の Au 輝線を通して酸消化サンプル中の Au を測定して定量されました。簡単に説明すると、10 mg のオーラノフィンを充填した NP を正確に秤量し、反応器のテフロンジャケット付きスチールケースに入れました。次に、10 ～ 20 mL の濃フッ化水素酸/硝酸 (1:1) (Panreac) を静かに加え、完全に消化されるまで 48 時間適度に加熱しました。最後に、透明な黄色の溶液を 10 mL メスフラスコに移し、測定しました。達成された薬物負荷は、すべての合成において NP 1 グラムあたり 1.8 ～ 6.2 mg のオーラノフィンでした。

インビトロ放出研究は、0.5 mL の新鮮なリン酸緩衝食塩水 (PBS) 溶液 (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 および 1.8 mM KH2PO4 [pH 7.4 に調整]) にロードされた PLGA NP 10 mg を分散させて実行されました。そして、０．４μｍ（平均孔径）のポリカーボネート膜を備えたトランスウェル透過性支持体上に配置した。ウェルを 1.0 mL の PBS pH 7.4 で満たし、すべての実験中、懸濁液を 37 °C で 100 rpm で軌道上で振盪しました。 1 時間ごとに、1 mL のサンプルを Transwell プレートから取り出し、新しい PBS と置き換えました。分離および定量は、ＵＶ－Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣによって実行され、２－ニトロ－５－チオベンゾエートの吸光度（ＮＴＢ、λｍａｘ４０９ｎｍ）を測定した。 NTB は、チオール基が 5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸) (DTNB) と反応してジスルフィド結合を開裂し、中性 pH の水中で NTB が得られるときに生成されます。オーラノフィンを含むサンプルは、金とチオールの結合を切断するために KI で処理されました 46。この目的のために、Sigma が提供する標準プロトコールに従って、50 μL KI 2.0 M を含む 250 μL のサンプルを 50 °C の超音波槽に 20 分間入れ、すぐに氷冷しました。流速 1 mL 分の ACN:MeOH:水 (3:3:94、v:v:v) の定組成移動相に基づく HPLC (Waters Alliance 2695) 分離モジュール (米国マサチューセッツ州ミルフォード) - 1 を使用して、4.2 分の保持時間で NTB シグナルを分離および定量しました。このシステムには、354 nm の可変波長ダイオードアレイ検出器 Water 2996 が装備されていました。 Waters X-Terra RP-18 逆相カラム (4.6 × 250 mm、5 μm) を 40 °C で使用し、ケースに応じて 10 ～ 50 μL の注入量を選択しました。反応を説明するスキーム、オーラノフィンの誘導体化のプロトコル、および3Dクロマトグラムを図S1に示します。

オーラノフィンを担持した NP の殺菌効果は、550 nm での光学密度 (OD550) を 6 時間追跡し、この時点での生存細胞を観察しました。簡単に説明すると、S. pneumoniae および S. pyogenes 株 (表 1) を、酵母抽出物 (0.8 mg mL-1; Difco Laboratories) を添加した C 培地 47 および Todd-Hewitt 培地で、振盪せずに 37 °C でそれぞれ増殖させました。細菌が対数増殖期（OD550 ≈ 0.3）に達したら、培養物を遠心分離し、PBS で 2 回洗浄し、最終的な OD550 を PBS で ≈ 0.6 に調整しました。次に、再懸濁した細菌をプラスチックチューブに移し、最終濃度が 0.1、0.25、または 0.5 μM のオーラノフィンになるように、さまざまな量のオーラノフィン-PLGA NP (PBS に懸濁) を加えました。負荷されていないPLGA NPまたはオーラノフィンのみを同じ濃度で含む対照サンプルは、常に並行して実行されました。それぞれ NP とオーラノフィンを可溶化するために使用される PBS とジメチルスルホキシド (DMSO) による追加のコントロールも含まれていました。すべてのサンプルを 37 °C で 6 時間インキュベートし、選択した時点で OD550 と生存細胞を測定しました。生細胞計数は、５％脱線維素化羊血を補充したトリプトース血液寒天ベースプレート（Difco Laboratories）中で実施した。各サンプルについて、10 倍希釈系列を PBS で調製し、各希釈液 10 μL をプレーティングしました。 37℃で一晩インキュベートした後、コロニーをカウントしました。

肺炎球菌バイオフィルムは、カプセル化されていない実験室株 R649 からの誘導体である、lytA lytC 二重変異体 48 である肺炎連鎖球菌株 P046 を使用して生成されました。ポリスチレンプレート上でのバイオフィルム形成の最適条件は、他の場所で説明されています50。つまり、すべてのバイオフィルムは、Costar 3595 96 ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート (Corning、ニューヨーク、米国) で形成されました。細胞を酵母抽出物（0.8 mg mL-1）を添加したC培地でOD595での光学密度が0.5〜0.6になるまで増殖させ、遠心分離によって沈降させ、等量のC培地に再懸濁し、希釈し、2.2×を含む200μLの一部を調製した。 104 CFU を各ウェルに分注しました。 34℃で16時間インキュベートした後、浮遊培養物を除去し、得られたバイオフィルムをPBSで2回洗浄し、その後、さまざまな濃度のオーラノフィンまたはオーラノフィンNPで37℃でさらに6時間処理しました。 DMSO または未負荷の NP を含むコントロールもアッセイしました。その後、上清を再度除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１０倍希釈系列を調製した。各希釈液 10 μL を血液寒天プレートにプレーティングし、37 °C で一晩インキュベートした後、コロニーを計数しました。化膿連鎖球菌バイオフィルムは、以前に記載されているように、SF370 株を使用して生成されました 51。簡単に説明すると、化膿連鎖球菌の一晩培養物を、酵母抽出物（0.8 mg mL-1）を補充した新鮮なトッドヒューイット培地で1:20に希釈し、ポリスチレンマイクロタイタープレートで37℃で24時間静的に増殖させました。インキュベーション後、肺炎球菌バイオフィルムについて上述したのと同じプロトコールに従った。

CLSMによってバイオフィルムを観察するために、肺炎球菌P046株をガラス底のWillCoディッシュ（WillCo Wells）上で34℃で16時間増殖させた。インキュベーション後、培地を除去し、バイオフィルムを PBS でリンスして非付着細菌を除去し、その後 1 μM のオーラノフィン NP で 37 °C でさらに 6 時間処理しました。 PBS または未負荷の PLGA NP を含むコントロールバイオフィルムもアッセイしました。その後、上清を再度除去し、細菌集団の生存率をモニタリングするために、LIVE/DEAD BacLight 細菌生存率キット L-13152 (Invitrogen-Molecular Probes) で染色しました。細胞膜が損傷している細胞（死んでいるか死にかけていると考えられる）は赤色に染まりますが、膜が損傷していない細胞は緑色に染まります48。バイオフィルムは、Leica TCS-SP2-AOBS-UV CLSM を使用して 63 倍の倍率で観察されました。励起/発光の最大値は約 488/500 ～ 546 nm でした。画像はLCSソフトウェア(Leica)を使用して分析した。投影は、x-y 平面を通じて取得されました (0.5 μm 間隔での個々のスキャン)。

肺炎球菌感染モデルは、ZFBioLabs (Tres Cantos、スペイン) から入手した野生型ゼブラフィッシュ胚 (Danio rerio) を使用した、以前に記載された方法 35 に基づいていました。簡単に説明すると、受精後 24 時間で胚をプロナーゼ (2 mg mL-1) で 1 分間処理することにより絨毛膜を除去し、96 ウェルプレートに分配し、100 μL の E3 培地でインキュベートしました。受精後 48 時間で、胚を 2.5 × 108 コロニー形成単位 (CFU) mL-1 の S. pneumoniae 株 D39 の懸濁液 100 μL で感染させました。細菌接種力価は、実験ごとに段階希釈およびトリプトース血液寒天プレート上にプレーティングすることによって計算した。感染の7時間後、感染した胚をE3培地で徹底的に洗浄して細菌を除去し、オーラノフィン（0.1、0.25または0.5μM）またはオーラノフィンをロードしたNP（同じ濃度の薬剤を含む）を補充した同じオートクレーブ滅菌した新鮮な培地100μLで徹底的に洗浄しました。）を追加しました。処理なしの非感染対照、またはDMSO、オーラノフィン、または負荷されていないPLGA NPのいずれかで処理された非感染対照を、同じ方法で洗浄した。胚を無菌条件下 27.5 °C でインキュベートし、毎日新鮮な E3 培地を交換しながら、すべてのサンプルの死亡率を 5 日間追跡しました。ゼブラフィッシュの胚は、凝固が観察され、15 秒間の観察中に心拍が消失した場合に死亡したとみなされました。各実験は少なくとも 3 回繰り返され、条件および実験ごとに 24 ～ 36 個の胚が使用されました。

ゼブラフィッシュ胚を用いたすべての実験は、動物の保護に関する新しい EU 指令 2010/63/EU に厳密に従って行われました。感染の兆候は、実験期間中毎日 3 回監視されました。瀕死の胚を、200 mg mL-1 のトリカイン (MS222) (Sigma-Aldrich) に浸漬することで麻酔をかけ、続いて氷水 (氷 5 部/水 1 部、0 ～ 4 °C) に少なくとも 20 時間浸漬して固定しました。低酸素による死亡を確実にするために必要な分。これらの実験プロトコルの承認は、動物実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護のための基本基準を定めるスペイン王政令 53/2013 によって付与されました。

生きている胚（感染後 5 日）を上記のように確実に死滅させるために処理し、3% メチルセルロースを含む窪みスライドにマウントし、QImaging MicroPublisher 5.0 RVT カメラを備えた Olympus SZX16 立体視鏡で撮影しました。画像はNIH ImageJで処理した。記載されているすべての実験について、表示されている画像は少なくとも 90% の個人で観察された効果を表しています。

すべての in vitro の結果は、独立した実験を繰り返して得られたデータを表しており、各値は 3 ～ 4 回の反復の平均標準偏差を表しています。統計分析は両側スチューデント t 検定 (2 つのグループ) を使用して実行されましたが、多重比較には分散分析 (ANOVA) が選択されました。すべての in vivo データについて、ログランク (Mantel-Cox) 検定と Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定を使用して、生存曲線を描画、分析、比較しました。統計分析には、GraphPad InStat バージョン 5.0 (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用しました。

この記事を引用する方法: Díez-Martínez, R. et al. 連鎖球菌感染症と戦うための新しい治療ツールとしてのオーラノフィンを組み込んだナノ粒子。科学。議員第6号、19525年。土井: 10.1038/srep19525 (2016)。

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原稿を批判的に読んでくださった E. García に感謝します。 E. Cano の優れた技術支援に深く感謝いたします。この研究は、スペイン経済競争力大臣からの助成金によって資金提供されました (SAF2012-39444-C02-01、MAT2012-35556 および CSO2010-11384-E、Aging Network of Excellence)。また、SEM 分析については UCM の国立電子顕微鏡センターに感謝します。

ロベルト・ディエス＝マルティネス

現在の住所: The Zebrafish Lab、Plaza CEIN 5 A4、31110、ノアイン、ナバラ、スペイン

ディエス・マルティネス・ロベルトとガルシア・フェルナンデス・エステルも同様にこの作業に貢献しました。

分子微生物学および感染生物学部門、生物学研究センター (CSIC)、マドリード、28040、スペイン

ロベルト・ディエス＝マルティネス、エステル・ガルシア＝フェルナンデス、ミリアン・ドメネク、ペドロ・ガルシア

呼吸器疾患CIBER (CIBERES)、マドリード、スペイン

ロベルト・ディエス＝マルティネス、エステル・ガルシア＝フェルナンデス、ミリアン・ドメネク、ペドロ・ガルシア

マドリードのコンプルテンセ大学薬学部、無機および生物無機化学学科、健康研究所病院 12 de Octubre、i+12、Pz/ Ramón y Cajal s/n、Madrid、28040、スペイン

ミゲル・マンサーノ、アンヘル・マルティネス、マリア・ヴァレット・レジ

CIBER of Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)、スペイン

ミゲル・マンサーノ、アンヘル・マルティネス、マリア・ヴァレット・レジ

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MV-R。そしてPGがこの研究を発案した。 RD-M.、EG-F.、MM、MV-R. そしてPGが実験を設計しました。 RD-M.、EG-F.、MD、AM、MM が実験を実施し、データを分析しました。 RD-M.、EG-F.、MM、MV-R. そしてPGが論文を書きました。著者全員が結果について議論し、原稿を編集して承認しました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ディエス・マルティネス、R.、ガルシア・フェルナンデス、E.、マンツァーノ、M. 他連鎖球菌感染症と戦うための新しい治療ツールとしてのオーラノフィンを組み込んだナノ粒子。 Sci Rep 6、19525 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep19525

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受信日: 2015 年 7 月 22 日

受理日: 2015 年 12 月 14 日

公開日: 2016 年 1 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19525

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