2011 年、米国ペンシルベニア州における新たに出現した鳥レオウイルス変異体および新規株の分離と分子的特徴付け

Scientific Reports volume 5、記事番号: 14727 (2015) この記事を引用

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ブロイラーと七面鳥の群れの鳥レオウイルス（ARV）感染は、2011年以来、ペンシルベニア州（PA）で重大な臨床疾患と経済的損失を引き起こしている。ARVに感染した鳥のほとんどは重度の関節炎、腱鞘炎、心膜炎、成長抑制または発育阻害症候群を患っていた。 (RSS)。 ARV の影響を受けた群れでは高い罹患率 (最大 20% ～ 40%) が観察され、群れの死亡率が 10% に達することもありました。 七面鳥の ARV 感染は、2011 年にペンシルバニア州で初めて診断されました。2011 年から 2014 年までに、罹患したペンシルバニア州の家禽から合計 301 件の ARV が分離されました。 ほとんどの ARV 流行を代表する 114 の野外分離株のシグマ C 遺伝子の分子的特徴付けにより、配列決定された 114 の ARV 分離株のうち 21.93% のみが ARV ワクチン株 (S1133、1733、および 2048) と同じ遺伝子型決定クラスター (クラスター 1) に属していたことが明らかになりました。 ）、一方、配列決定された分離株の78.07％はジェノタイピングクラスター2、3、4、5および6（ワクチン株とは異なる）に属しており、新たに出現したARV変異体を表していました。 特に、遺伝子型決定クラスター 6 は、野外分離株の 10 個の新規 PA ARV 変異体で初めて同定された新しい ARV 遺伝子型でした。

鳥レオウイルス (ARV) は自然界に広く存在しており、ニワトリ 3、4、キジ 5、七面鳥 6、7、アヒル 8、9、10、ガチョウ 11、ハト 12、ウズラ 13、14、 15、猛禽類 16、オウム類 17。 しかし、ARV 感染による臨床疾患のほとんどは、ブロイラーおよびブロイラー育種鶏で観察されます 18。 若いブロイラーで最も一般的な臨床症候群は、腱鞘炎、吸収不良症候群、発育阻害症候群 (RSS)、腸疾患の問題および免疫抑制です19、20、21、22、23。 家禽における ARV 感染は、いくつかの経済的に重大な影響を及ぼします。 これらには、死亡率の増加、全般的な成績の低下、体重増加の減少、飼料変換の低下、不均一な成長率、影響を受けた鳥の市場性の低下、ウイルス性関節炎/腱鞘炎、他のウイルスや細菌による二次感染が含まれます2,22。

ARV は、レオウイルス科のオルソレオウイルス属に属します 24,25。 それらには、セグメントの電気泳動移動度に基づいて 3 つの L (大)、3 つの M (中)、および 4 つの S (小) サイズ クラスを含む 10 の二本鎖 RNA (dsRNA) ゲノム セグメントが含まれています 26。 研究結果により、S1 ゲノムセグメントによってコードされるシグマ C タンパク質が細胞接着タンパク質であり、ARV の主要な抗原決定基であることが明らかになりました。 既存のニワトリ ARV 株の S1 ゲノムセグメントはよく特徴付けられており、ニワトリ由来のウイルスでよく保存されています 27、28、29、30。 近年米国中西部で流行しているトルコ由来の ARV 株は、ニワトリ由来の ARV 株とは抗原的に異なります。 七面鳥由来の ARV 株は、オルソレオウイルス属内の別のウイルス サブタイプと考えられています 31、32、33。

2011年以来、米国ペンシルベニア州（ペンシルバニア州）で新たに発生したARV感染症が発生し、それ以来、ペンシルベニア州の家禽産業に重大な病気と経済的損失を引き起こしています。 ブロイラー鶏におけるこれらの ARV 感染のコストを控えめに見積もっても、影響を受ける鶏一羽あたり 23,000 ドル (一鶏あたり 28,000 羽) であり、七面鳥会社は 1 年間で 300 万ドルの損失があると見積もっています。 発生が観察される前に、ARV に対する従来のワクチンによるワクチン接種が採卵鶏やブロイラーの飼育者で実施されていました。 しかし、これらの従来のワクチンは、野外の ARV 感染に対する防御を与えるとは考えられませんでした。 この時まで、七面鳥​​の飼育群には ARV ワクチンが投与されていませんでした。 ARV ワクチン接種は、商業鶏、ブロイラー、七面鳥の群れでは実施されていませんでした。 市販の七面鳥やブロイラーの群れで変異型 ARV 感染が検出されて以来、養鶏業界は繁殖用の群れに死滅した自家 ARV ワクチンを接種することに頼ってきました。

ブロイラー鶏と七面鳥の ARV 感染症は、2011 年以来ペンシルバニア州で診断されることが増えており、引き続き観察されています。 2011 年から 2014 年までに、当研究室でのウイルス分離により 301 例（群れ）が ARV 感染であることが確認されました。 ARV陽性症例のほとんどには、重度の関節炎/腱鞘炎を患った病気のブロイラーや七面鳥が含まれており、膝関節、飛節、足蹠を含む脚の複数の関節と腱が侵され、周囲の筋肉組織にまで炎症が広がっていました。 高い罹患率 (20 ～ 40%) と死亡率 (最大 10%) がしばしば存在しました。 この論文では、米国ペンシルバニア州からのこれらの ARV 変異体の単離と分子的特徴付けにおける診断および研究の結果について説明します。

ARV 感染は、2011 年以降、ペンシルバニア州の家禽、特にブロイラーと七面鳥に重大な臨床的疾患と経済的損失を引き起こしています。 七面鳥の ARV 感染は、2011 年 6 月にペンシルバニア州で初めて診断されました (表 1、#54: Reo/PA/Turkey/12883/11)。 ARV に感染したブロイラーと七面鳥の群れは、大腿脛骨足根関節、足根間関節、足底中足骨領域に及ぶ腱鞘炎により、重度の跛行と開張脚に悩まされ、場合によっては炎症が周囲の筋肉組織にまで及ぶこともあります（図 1a、b）。 病気の発症は通常、ブロイラーの群れでは生後 2 ～ 4 週目で、七面鳥​​の群れでは生後 10 週目以上で起こります。 ARV に感染した鳥の群れでは高い罹患率 (最大 20% ～ 40%) が一般的に観察され、最も重篤な場合の死亡率は最大 10% でした。 主要な肉眼的病理学的病変の存在には、腱および腱鞘の顕著な腫れ、浮腫、出血が含まれ、より慢性的な場合には重度の出血を伴う全層腱断裂が含まれます（図1c、d）。 一部の罹患鳥には心膜炎病変も存在しました（図1e）。 顕微鏡的には、影響を受けた組織の主な炎症細胞タイプはリンパ球と形質細胞でした（図1f）。

2011 年から 2014 年にかけて、合計 301 羽の ARV 野外分離株が当研究室で得られました。そのほとんどは ARV に感染した鳥の腱から、一部は他の組織 (心臓、肝臓、腸) からのものでした。 ウイルスの単離は、LMH (ATCC CRL-2113) 単層細胞培養で実施されました (図 2、1a)。 ARV 野外分離株 301 株のうち、206 株はブロイラー、18 株は鶏、63 株は七面鳥、7 株はチュカルヤマウズラ、4 株はホロホロ鳥、2 株はワラキジ、1 株はコブシロウズラでした (補足表 1)。 巨大な、または「ブルームのような」細胞変性効果（CPE）は、LMH細胞培養におけるARV感染の特徴でした（図2、1b〜d）。 301個のARV分離株はすべて、巨大または「ブルーム状」CPE陽性細胞によって確認され、その後、蛍光ARV抗体を使用した蛍光抗体（FA）検査によってARV陽性に染色されました（図2b〜d）。 CPE の潜伏期間はさまざまでした。最も早い CPE は接種後 24 時間 (pi) に観察されました。 いくつかのケースでは、4回連続細胞継代を行った後に最新の状態が観察されました。 そして、ほとんどの ARV 陽性症例では、CPE は 2 ～ 3 回の連続細胞継代以内に感染後 3 ～ 5 日目に観察されました。

2011 年から 2014 年の間に診断されたブロイラー、採卵鳥、七面鳥、キジ、ホロホロ鳥の ARV 症例を代表する合計 114 羽の ARV 野外分離株が、σC 遺伝子の S1 セグメントの分子特性解析のために選択されました (表 1)。 114 個の ARV 分離株のそれぞれは、P1/P4 プライマーを使用した S1 ベースの RT-PCR によって 1088 bp フラグメントとして正常に増幅されました 34。 その後、PCR 産物は精製され、S1 遺伝子配列決定のためにペンシルベニア州立ゲノミクスコア施設に提出されました。

系統樹の構築と、GenBank から取得した別の 28 の参照株配列 (補足表 2) を使用した 114 の ARV フィールド株 (表 1) の σC 遺伝子 S1 セグメント配列の保存に関する分析により、114 の ARV フィールド株が PA 家禽から分離されたことが明らかになりました。は、6 つの遺伝子型クラスター、または遺伝子型にグループ化されました (図 3)。 これらのクラスター内の 114 の野外株のうち、25 (21.93%) は標準 ARV ワクチン株 (S1133、1733、2048) と同じクラスター (クラスター 1) にありました。 クラスター 2 では 38 (33.33%)。 クラスター 3 および 4 では 7 (6.14%)。 クラスター 5 では 27 (23.68%)。 クラスター 6 では 10 (8.77%) でした (表 2、図 3)。 特に、遺伝子型決定クラスター 6、または遺伝子型 6 は、PA 家禽で検出された 10 の ARV フィールド株において初めて同定され、これらの株は新規であり、以前に公開されたすべての ARV 参照株とは異なります。

2011年から2014年に米国のペンシルベニア州で分離された114の鳥レオウイルス（ARV）野外株の6つの遺伝子型決定クラスター（6つのコード色）を示す系統樹。

分析は、σC 遺伝子配列の 300 アミノ酸配列に基づいて行われました。 枝の長さは配列間の進化上の距離に比例します。 スケールは位置ごとのヌクレオチド置換を表します。 GenBank から取得した 28 の ARV 参照株の名前はクラスター 1 ～ 5 のみにあります (フィールド株と区別するために太字で表示されています)。

アミノ酸 (aa) 配列の予測 (1 ～ 300) のペアワイズ比較を実行して、114 個の PA ARV フィールド株と GenBank から取得した 28 個の ARV 参照株の間の σC 遺伝子の相同体の配列同一性の程度を調べました (図3）。 一般に、σC をコードする遺伝子の aa 配列の同一性は、114 の PA ARV フィールド株の間で劇的に異なる (40% から 100%) ことが判明しました。 6 つのジェノタイピング クラスターのいずれか 2 つの間での aa 類似性は 60.8% 未満でした。 各クラスター内の aa 類似性の間には、さまざまな程度の差異が観察されました。

ARV ジェノタイピング クラスターとサブクラスターの分類は、ブートストラップ値 (1000 の擬似複製で実行された分析) に基づいていました。 114 のフィールド株と 28 の参照株を一緒にプロットして系統樹 (円ツリーまたは線形ツリー) を構築した場合、クラスターとサブクラスターを明確に示す点で、円ツリー (図 3) の方が線形ツリーよりも優れていました。

クラスター 1 のジェノタイピング (図 3) では、25 の PA ARV 野外系統が高い配列同一性 (71.0 ～ 100%) を共有し、それらは 3 つの異なるサブクラスターに分割されました。サブクラスター 1 は 16 の PA ブロイラー系統によって形成され、共通点を共有しました。 98.4 ～ 100% の aa 同一性。 サブクラスター 2 は、5 つのブロイラー系統と 3 つの層系統によって形成され、80.6 ～ 97.6% の aa 同一性を共有しました。 GenBank から取得した標準ワクチン株と残り 1 つの PA ブロイラー株を含む 11 の ARV 参照株すべてがサブクラスター 3 を形成しました。サブクラスター 1 および 2 の 24 の PA ARV フィールド株は、ARV の 70.6 ～ 88.8% の同一性のみを共有しました。 ARV 参照株およびサブクラスター 3 の 1 PA ARV ブロイラー株と 72.1 ～ 75.4% の aa 同一性。

クラスター 2 のジェノタイピングでは、38 の PA ARV フィールド株が広範囲 (58.8 ～ 100%) の aa 配列同一性を共有し、3 つの異なるサブクラスターを形成しました。 サブクラスター 1 は少数の鶏由来の系統によって形成されましたが、15 の七面鳥系統、2 つのチュカルヤマウズラ系統、2 つのブロイラー系統および 1 つのホロホロ鳥系統を含み、それらは 90.8 ～ 100% の aa 同一性を共有していました。 サブクラスター 2 は、11 羽のブロイラー系統と 1 羽のホロホロ鳥系統からなり、78.6 ～ 99.1% の aa 同一性を共有しました。 サブクラスター 3 には、5 つのブロイラー系統、1 つのレイヤー系統、および 3 つの参照系統が含まれており、それらは 66.0 ～ 100% の aa 同一性を共有していました。

クラスター 3 のジェノタイピングでは、5 つのブロイラー系統のうち 4 系統 (Reo/Broiler/PA/28439/11 を除く) および 2 層系統は、4 つの GenBank 参照系統と 77.8 ～ 80.5% の aa 同一性のみを共有しました。 クラスター 4 では、7 つの PA ARV 野外系統のすべてがブロイラー由来であり、7 つのうち 6 つが高い (93.1 ～ 99.1%) aa 同一性を共有していました。 残りの株 (Reo/PA/Broiler/05682/12) は AVS-B 株との類似性が高かった。 クラスター 5 は、ブロイラー 23 株、レイヤー株 2 株、七面鳥 1 株、ワザキジ 1 株を含む 27 株の PA ARV 野外株で構成され、互いに高い aa 配列同一性 (85.2 ～ 100%) を持ち、それらは中程度の関連性を示しました。このクラスター内の 5 つの参照株 (59.8 ～ 80.8%)。

新しいジェノタイピング クラスターであるクラスター 6 が、この研究で初めて特定されました。 9 つのブロイラー系統と 1 つの七面鳥系統を含む 10 の新規 PA ARV 野外系統は、クラスター 1 ～ 5 とは異なる新しい遺伝子型決定クラスター 6 を構築しました。共通の aa 同一性はクラスター 6 内では 71.0 ～ 99.9% でしたが、クラスター 6 内では 42.6 ～ 60.1% でした。他の 5 つのクラスター内にあります。

米国の PA 家禽で検出された遺伝子型 1 ～ 6 を表す σC 遺伝子型決定クラスターを特徴とする 114 の ARV 野株の σC 遺伝子配列は、2014 年 10 月 (KM 番号の 5) と 2014 年 1 月 (KP 番号の 51) に GenBank に寄託されました。 s) および 2015 年の 5 月 (KR 番号の 58) (表 1)。

腱および滑膜組織は、ARV 感染の症状と一致する臨床徴候および病変を示す鳥から ARV を分離するための好ましい標本でした 1,2,35。 心膜炎病変が観察された場合、または成長不良、吸収不良、または消化不良の臨床兆候が存在した場合には、心臓、肝臓、腸などの他の組織も採取される場合がありました。 剖検およびサンプル収集は、米国農務省 (USDA) によって承認されたガイドラインに従って、ペンシルベニア州立大学動物診断研究所の剖検施設で行われました。 (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf)。

収集した各組織標本を 20 ml の滅菌プラスチック容器 (カタログ番号 14310-684、www.vwr.com) 内で滅菌ハサミで切り刻み、ウイルス輸送培地で 1:5 (w/v) に希釈しました。 次に、混合物をストマッハバッグに入れ、ストマッハブレンダー（モデル 80、スワード社、英国）で 2 ～ 3 分間均質化しました。 その後、組織ホモジネートを 15 ml の滅菌ポリプロピレン円錐管に移し、5 ℃、1200 rpm で 10 分間遠心分離しました。 最後に、上清を収集し、0.45 nm シリンジ フィルターで濾過して、ARV 単離のための細胞接種の準備を整えました。

LMH (ATCC CRL-2113) は、ジエチルニトロソアミン 36 による長期治療による雄レグホンニワトリの肝臓の腫瘍結節の化学変化から開発された原発性肝細胞癌上皮細胞株です。 LMH 細胞株は上皮表現型と樹状形態を持っています。 LMH 細胞は、ARV、家禽アデノウイルス、ビルナウイルス、ロタウイルス、ポックスウイルス、および当社の進行中の研究でテストされたその他の鳥ウイルスに対して非常に感受性が高いです。 LMH 細胞は、鳥ウイルスを分離して感染を診断する目的で、当社の鳥ウイルス研究室で日常的に培養されています。

LMH 細胞増殖培地の 1 つの調製物は、L-グルタミンおよび 15 mM HEPES (Corning Cellgro、Ref. 10-092-CV、米国）、50 mlのウシ胎児血清（FBS）、5 mlのPSA（Pen-Step-Amp）（Cellgro、参照番号30-004-CI）、および2.5 mlの硫酸ゲンタマイシン(10mg/ml)。 LMH 細胞維持培地の組成は、FBS が 2% (または 10 ml) しか含まれていないことを除いて、増殖培地の組成と同じです。 LMH 細胞の培養手順を簡単に説明すると、次のとおりです。 (1) ストック LMH 細胞 (T-25 cm2 フラスコあたり 1 ml を調製、少なくとも 1 × 106/生細胞) のバイアルを液体窒素タンクから取り出し、 37 °C のウォーターバスで急速解凍し、4 °C、1000 rpm で 10 分間遠心分離します。 上清を廃棄した。 あるいは、進行中の LMH 細胞培養の 1 つのフラスコを、ルーチンの細胞培養手順ごとに 1:4 ～ 1:6 の比率で継代培養するために処理しました 37。 （２）ＬＭＨ細胞継代培養のために、細胞ペレットを１ｍｌの予熱した増殖培地で再懸濁し、１：２０の比（すなわち、１ｍｌの細胞懸濁液、１９ｍｌの増殖培地）で希釈した。 (3) 細胞懸濁液はフラスコに依存しました (例: T-12.5 cm2 フラスコあたり 2.5 ml、T-25 cm2 フラスコあたり 5 ml、6 ウェル細胞培養プレートのウェルあたり 1.5 ～ 2 ml、または 1 ml) 12 ウェル プレート上のウェルごと。これらは私たちの研究室で鳥ウイルス分離の診断目的に日常的に使用されていました。 (4) LMH 細胞を播種したフラスコを、37 °C、5% CO2 に設定したインキュベーター内に置きました。 細胞の播種密度に応じて、48 ～ 72 時間以内にコンフルエントな単層が形成されました。 75% 以上のコンフルエンスの単層が形成されると、LMH 細胞フラスコは鳥ウイルス分離のための検体接種に使用できる状態になりました。 接種されていないLMH細胞フラスコは、最大50継代または100継代までの継続的な細胞株継代培養として機能しました。 標準的な細胞継代手順と同様に、種細胞フラスコは 1 ～ 2 週間維持でき、継代比は 1:4 ～ 1:8 でした 37。

私たちの研究室では、主に ARV またはその他の鳥ウイルスの分離に単層 LMH 細胞培養の T12.5 cm2 フラスコおよび 12 または 24 ウェル プレートを使用しました。 LMH増殖培地を細胞培養フラスコから除去し、次いで滅菌PBS(8.0g NaCl、0.2g KCl、1.15g NaH2PO4、0.2g KH2PO4、1000ml d-H2O)ですすぎ、細胞から残留FBSを除去した。 フラスコに、各標本調製物からの上清 0.25 ml (T12.5 フラスコの場合) または 0.5 ml (T25 フラスコの場合) を接種しました。 ネガティブコントロール細胞フラスコにVTMを接種した。 接種した細胞のフラスコは、接種材料を吸着させるために 37 °C のインキュベーターで 20 ～ 30 分間インキュベートしました。 LMH 維持培地 (T12.5 フラスコの場合は 2.5 ～ 3.0 ml、12 ウェル プレートの場合は 1 ウェルあたり 2.0 ml、24 ウェル プレートの場合は 1 ml/ウェル) をフラスコに加え、37 °C でインキュベートしました。 CO2 5%以下。 検体を接種した単層を、ウイルス細胞変性効果（CPE）の発現について 5 ～ 7 日間毎日検査しました。 陰性結果を確認するために、各標本に対して 2 ～ 3 回の連続細胞継代を日常的に実施しました。 ARV またはその他の一般的な鳥腸内ウイルス感染症 (アデノウイルス、ロタウイルス、ヘルペスウイルス、ビルナウイルスなど) による陽性 CPE は、一般に 1 ～ 3 細胞継代以内に判定されました。

この研究では、初期 CPE 細胞の FA 染色を含む、我々が開発した新しい手順が、ARV の早期検出に日常的に使用されました。 簡単に言うと、これらの手順には次のステップが含まれます。 (1) 細胞が CPE を受けることが観察されたときに、ウイルス CPE 細胞を含む 1 ml の細胞培養液のサンプル (細胞培養を停止することなく) を標本を接種した細胞培養フラスコから採取しました。そして単層から媒体中に放出される。 （２）細胞培養液サンプルを９００ｒｐｍで遠心分離し、ＣＰＥ細胞をスピンダウンした。 （３）培地上清を元のフラスコ（培養を継続）に戻し、ＣＰＥ細胞を約１：５の比率でＰＢＳに再懸濁した。 (4) 再懸濁した CPE 細胞を、サンプルあたり 0.1 ～ 0.2 ml の PBS (または 1 ～ 2 滴) を含む 25 × 75 × 1 mm の顕微鏡スライドガラス (Globe Scientific, Inc.、ニュージャージー、米国) 上に置きました。自然乾燥用の直径 10 ～ 12 mm の円形。 (5) スライドを冷 (-20 °C) アセトンで 10 分間固定し、サンプル領域をインク ペンまたはダイヤモンド ペンシルで丸で囲みました。 (6) CPE 細胞を蛍光タグ付き抗 ARV 抗体 (ID No. 680 VDL 9501、NVSL、エイムズ、アイオワ州、米国) で染色し、スライドを 37 °C のインキュベーター内の湿度チャンバーに 30 分間置きました。暗闇の中で40分。 （7）PBS でスライドの一端を穏やかに洗い流すことによって蛍光抗体を除去し（これにより細胞を除去しません）、その後スライドを合計 3 回の洗浄ごとに 2 ～ 3 分間 PBS で満たしました。 次に、スライドをペーパータオル上に面を上にして置き、自然乾燥させました（または、スライドをスライドホルダーに置き、底にスターラーバーを備えたガラススライドジャーに置き、ガラスジャーがPBSで満たされるまでPBSで満たしました）スライドに蓋をし、スライドジャーを穏やかな撹拌速度に調整したスターラープレート上に8～10分間置き、洗浄を完了しました。 （８）スライドを封入剤（５０％ＰＢＳ緩衝液、５０％グリセロール、ｐＨ８．４）で封入し、その後の検査のために染色領域をカバースリップの下に置いた。 １または２時間以内に観察する場合にはスライドを室温に保ち、それ以外の場合には２４時間以内に観察するために冷蔵庫に保管した。 ARV に対して陽性の CPE 細胞はリンゴ緑色に染色されました。

細胞培養におけるウイルス分離の従来の手順では、かなりの量の CPE 開発 (> 50 ～ 70%) と、その後のウイルス同定検査を実施して陽性分離株を確認するための細胞培養の停止が必要です。 特にこのプロジェクトにおける ARV 分離の新しい手順を使用することにより、ほとんどの ARV 陽性症例で早期ウイルス分離が達成されました。 FA 染色による ARV 陽性の確認には少数の初期 CPE 細胞 (わずか 5 ～ 10 個) しか必要とされなかったため、ARV 診断のためのウイルス分離結果は、ARV 診断の時点より (平均して) 2 ～ 3 日早く得られました。細胞培養プレートの終了のために 50 ～ 70% を超える CPE が発生する。

製造業者の指示に従って、RNeasy Mini Kit (カタログ番号 74106、QIAGEN、カリフォルニア州バレンシア) を使用して、細胞培養上清からウイルス RNA を抽出しました。 抽出された RNA をテンプレートとして使用し、公開されているプラ​​イマー P1/P434 を使用して ARV S1 セグメントから 1088 bp フラグメントを増幅しました。 RT-PCR アッセイは、10 μl のテンプレート RNA、25 μl の RNase フリー水、10 5 × バッファー μl、dNTP ミックス 2 μl (各 dNTP 10 mM)、酵素ミックス 1 μl、および 2 つのプライマーそれぞれ 1 μl。 Applied Biosystems 9700 サーマルサイクラーを使用し、50 °C で 30 分間の逆転写ステップを使用して増幅を実行しました。 最初の PCR 活性化ステップは 95 °C で 15 分間に設定されました。 次に、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で90秒間の各サイクルを38サイクル行った。 最後に 72 °C、5 分間の 1 サイクルで完了しました。

ARV S1 セグメントの RT-PCR 産物を単離し、臭化エチジウム染色アガロースゲルで視覚化しました。 特定の 1088 bp バンドを切り出し、単純な結合/洗浄/溶出手順を使用してゲル抽出キット (ロット番号 04113KE1、Axygen、マサチューセッツ州テュークスベリー) のスピンカラムにロードしました。 精製した PCR 産物を NanoDrop™ 1000 (Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) 分光光度計を使用して測定し、40 ng/μl に希釈して配列決定テンプレートとして使用しました。 すべてのサンプルと P1/P4 プライマー (1 μM) を、3730XL DNA アナライザー (Applied Biosystems、ニューヨーク州グランドアイランド) を使用したサンガー配列決定のためにペンシルベニア州立ゲノミクスコア施設に提出しました。

この研究では、系統解析に隣接結合法を使用しました。 Lasergene 12 Core Suite (DNASTAR, Inc.、米国ウィスコンシン州マディソン) を、サンガー配列決定データのアセンブリ、ORF 予測、およびヌクレオチド配列の翻訳に使用しました。 BLASTN 検索を使用して、ARV フィールド株と GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) の参照株の間の配列類似性を調査しました。 系統解析は、σC 遺伝子 (900 塩基) の S1 セグメント (ヌクレオチド 525 ～ 1424) に対して実行されました。 配列アラインメントは、ClustalW 1.83プログラム(http://align.genome.jp)を使用して実施した。 隣接結合ツリーと最尤法 (ML) ツリーが生成され、MEGA プログラム (バージョン 5.0) で実装されているブートストラップ解析によって、1000 回のブートストラップ複製後の絶対距離によるツリー トポロジが検証されました 38。

臨床診断および剖検診断の方法は、米国農務省 (USDA) によって承認されたガイドラインに従って実行されました。 (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf)。 すべての実験プロトコルは、ペンシルバニア州立大学研究保護局によって承認されました。

ウイルスの分離には時間がかかりますが、診断ウイルス学では常に好まれており、新しいウイルスや新たに出現した野外株や変異株を発見する際に非常に重要です。 この研究では、培養細胞中のウイルスを早期に検出するために新しく修正された手順が、ARV 症例の早期診断に効果的に使用されました。 標本を接種した細胞培養物中に少数の CPE 細胞が観察されるとすぐに、細胞培養を停止することなくウイルス分離結果を確認するために ARV FA 染色のために CPE 細胞のサンプルを収集しました。 これにより、50 ～ 70% の CPE が発生するまで待つ必要がある従来のウイルス分離手順よりも早い診断が可能になりました。 新しい手順を使用すると、ほとんどの ARV 症例で平均して 2 ～ 3 日早くウイルスが分離されました。 さらに、この新しい手順では、濃縮された CPE 細胞を使用するため、明確な結果が得られ、重複したスライドを準備することで、追加の疑わしいウイルスを同時に検出することができます。

σC は ARV39 の中で最も変化しやすいタンパク質です。 それは標的細胞へのウイルスの付着を媒介し、σC に特異的な抗体は ARV 感染を中和します 40,41。 この研究では、σC 遺伝子配列の系統解析から得られた研究結果により、114 の ARV 野株が遺伝的に異なり、6 つの遺伝子型クラスター、または遺伝子型に分類されていることが明らかになりました (図 3)。 クラスター 2 ～ 6 の分離株 114 株のうち 90 株は野外変異株であり、クラスター 1 に分類される標準的な ARV ワクチン株 (S1133、1733、2408) とは異なりました。さらに重要なのは、新規の遺伝子型解析クラスター (クラスター 6) でした。今回の研究で初めて判明した。 PA 家禽で検出された 10 の新規 ARV フィールド株 (ブロイラー鶏から 9 株、七面鳥から 1 株) は新規 ARV ジェノタイピング クラスター 6 を形成し、株は高い遺伝的多様性を示しました (相互に最大 30% の差異)。

ジェノタイピングクラスター 1 内では、25 の PA ARV フィールド株のうち 24 が別個のサブクラスターを形成し、ARV ワクチン株サブクラスターとの差異を示し、これらのサブクラスター間の低い aa 同一性 (70.6 ～ 88.8%) は、24 の PA ARV が野外株はワクチン株と同一ではないか、ワクチンに関連した野外変異株である可能性があります。 同様に、サブクラスター間の同一性の差異は、ジェノタイピングクラスター 2、3、4、および 5 でも観察されました。そこでは、PA ARV フィールド株の大部分が独自のサブクラスターを形成し、他の場所で検出された ARV 参照株と区別されます (オランダ、ドイツ、米国、台湾）（図 3、S 表 2）。 それにもかかわらず、新規の遺伝子型決定クラスター 6 およびクラスター 1 ～ 5 の新たに出現した野外株または変異体は、ARV の革命的な突然変異または再結合が発生したか、継続的に発生しており、追加の ARV 野外変異体または新規株が引き続き生成される可能性があることを示しています。

クラスター 2 のジェノタイピングでは、サブクラスター 1 は、PA で検出された七面鳥 15 系統、チュカー 2 系統、ブロイラー 2 系統、ホロホロ鳥 1 系統で構成されていました。 これらの PA ARV フィールド株は、相互に 90.8% ～ 100%、2011 年に発生した 3 つの MN 七面鳥 ARV 株と 92.3% ～ 99.8% の範囲のヌクレオチド相同性を有しており、これらの PA ARV 株が中西部から伝播した可能性が高いことを示唆しています33。七面鳥由来の株。

各 ARV 株には、3 L (大)、3 M (中)、および 4 S (小) サイズ クラスの 10 個のゲノム セグメントが含まれているため 26、完全なゲノム配列の特徴付けにより、対象の ARV フィールド株のより詳細なゲノム情報が得られます。 従来のゲノム配列決定手順 42 を使用することにより、PA ブロイラー ARV 野外系統 (Reo/PA/Broiler/05682/12) の完全なゲノム特性評価を実施しました 43。 このブロイラー ARV のゲノム配列決定の結果、σC 遺伝子の S1 セグメントに最も大きな配列類似性が古典的な AVS-B 系統で観察されたことが明らかになりました。 ブロイラー ARV フィールド系統は、AVS-B 系統の M2 および M3 セグメントと中程度しか類似せず、最も低い配列類似性は M2 ゲノム セグメントの最も 5' 配列に現れました。

当社は現在、Next Generation Sequencing (NGS) Illumina MiSeq システム 44 を使用して、新たに出現した ARV 変異体と新規株の全ゲノム配列特性解析研究を実施しています。これにより、10 個のゲノムすべての完全な配列における変異遺伝子の位置を決定できます。セグメント。 NGS 技術の応用から得られた最近の科学的発見は、遺伝子解析に大規模並列プラットフォームを使用することの顕著な価値を浮き彫りにしています 45、46、47、48、49。 これらの新しい方法は、これまで焦点を当てていたさまざまな DNA 調製プロトコルからの読み取り値をゲノム全体のスケールに拡張し、これらの読み取り値の分解能を 1 塩基精度まで微調整しました。 RNA の配列決定も進歩しており、現在では全長 cDNA 解析、遺伝子発現ベースの方法の連続解析、およびノンコーディング RNA の発見が含まれています。 したがって、この ARV 研究を継続するために NGS 手法を適用することで、新たに出現した ARV フィールド変異体と新規株の完全なゲノム配列情報が得られ、これらの新規株がどのようにして革命的なゲノム変化を達成したかをより深く理解できるようになります。

ARV 感染に関連する臨床疾患を制限するための最も重要な制御アプローチは、ブリーダーに有効なワクチンを適切に接種することで、垂直感染の可能性を減らし、現在の野外株から保護する特定の母性抗体を子孫に提供することです。 この研究で報告されたσC遺伝子S1セグメントの配列特性解析に加えて、新たに出現したARVフィールド株の全ゲノム特性解析により、より詳細な科学データが得られ、ARVの変異、再結合、および関連する分子疫学の特徴をより深く理解できるようになります。 これらの研究は、効果的な自家死滅ウイルスおよび生ウイルスワクチンやその他の防御戦略の開発に役立ちます。

この記事を引用する方法: Lu, H. et al. 2011 ～ 2014 年、米国ペンシルベニア州における新たに出現した鳥レオウイルスの変異体と新規株の分離と分子的特徴付け。 科学。 議員 5、14727; 土井: 10.1038/srep14727 (2015)。

Rosenberger, JK、Sterner, FJ、Botts, S.、Lee, KP & Margolin, A. 鳥レオウイルスの in vitro および in vivo 特性評価。 I. いくつかの鳥レオウイルス分離株の病原性および抗原性関連性。 鳥類疾患 33、535–544 (1989)。

記事 CAS Google Scholar

ジョーンズ、RC、家禽の病気第 12 版。 (サイフ、YM 他編) Ch. 11、309–310 (Blackwell、2008)。

Google スカラー

Ide, PR & Dewitt, W. ノバスコシア州のブロイラー飼育者および子孫における鳥レオウイルス感染の血清学的発生率。 カナダの獣医学雑誌。 La revue veterinaire canadienne 20、348–353 (1979)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Gussem, J.、Swam, H.、Lievens, K. & De Herdt, P. レイヤ ブリーダーの群れにおけるレオウイルス腱鞘炎。 鳥類の病理学: Journal of the WVPA 39, 169–170 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Curtis, PE、Al-Mufarrej, SI、Jones, RC、Morris, J. & Sutton, PM レオウイルス、ブドウ球菌および環境要因に関連する若いキジの腱鞘炎。 獣医記録 131、293​​ (1992)。

記事 CAS Google Scholar

Giangaspero, M.、Vanopdenbosch, E.、Nishikawa, H. & Tabbaa, D. シリア産アワシ羊の生産性と関連した呼吸器ウイルス (パラインフルエンザウイルス 3 型、呼吸器合胞体ウイルス、レオウイルスおよびアデノウイルス) に対する抗体の保有率。 Trop Anim Health Prod 29、83–91 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

Taber, R.、Alexander, V. & Whitford, W. ウイルス耐性を引き起こす CHO 細胞の持続的なレオウイルス感染。 J Virol 17、513–524 (1976)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rey, ME、D'Andrea, E.、Calvert-Evers, J.、Paximadis, M.、Boccardo, G. 南アフリカで葉巻き症状を示すタバコに関連するフィトレオウイルスの証拠。 植物病理学 89、303–307 (1999)。

記事 CAS Google Scholar

Baroni, A.、Bertoncin, P.、D'Aprile, PN & Felluga, B. 鳥レオウイルスに感染したニワトリ胎児漿尿膜の超微細構造組織病理学。 Avian Pathol 9、341–354。

記事 CAS Google Scholar

Petek, M.、D'Aprile, PN & Cancellotti, F. 伝染性嚢病ウイルス (IBDV) の生物学的および物理化学的特性。 Avian Pathol 2、135–152 (1973)。

CAS PubMed Google Scholar

Palya、V. et al. 若いガチョウの病気の原因としてレオウイルスが特定されました。 鳥類の病理学: Journal of the WVPA 32, 129–138 (2003)。

記事 Google Scholar

Vindevogel, H.、Meulemans, G.、Pastoret, PP、Schwers, A. & Calberg-Bacq, CM ハトにおけるレオウイルス感染。 Ann Rech Vet 13、149–152 (1982)。

CAS PubMed Google Scholar

マギー、DL、モンゴメリー、RD、マスリン、WR、ウー、CC & ジャック、SW レオウイルスは若いコリンウズラの過剰死亡率と関連している。 Avian Dis 37、1130–1135 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Guy、JS、Levy、MG、Ley、DH、Barnes、HJ、Gerig、TM クリプトスポリジウムとレオウイルスによるコリンウズラ (Colinus virginianus) の腸炎の実験的再現。 Avian Dis 31、713–722 (1987)。

記事 CAS Google Scholar

Ritter、GD、Ley、DH、Levy、M.、Guy、J. & Barnes、HJ 腸クリプトスポリジウム症と腸炎を伴うコリンウズラ (Colinus virginianus) からのレオウイルス分離。 Avian Dis 30、603–608 (1986)。

記事 CAS Google Scholar

リーマン、H.ら。 捕獲された猛禽類と自由に生きている猛禽類の血清学的調査。 Raptor Research 11、104–110 (1977)。

Google スカラー

サンチェス＝コルドン、PJ 他オウム鳥 (Psittacus erithacus) におけるレオウイルス感染: 形態学的および免疫組織化学的研究。 Avian Dis 46、485–492 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Davis, JF、Kulkarni, A.、Fletcher, O. レオウイルス感染に関連した生後 9 日および 11 日のブロイラー育種鶏の心筋炎。 鳥類疾患 56、786–790 (2012)。

記事 Google Scholar

Davis, JF、Kulkarni, A.、Fletcher, O. 若いブロイラー鶏におけるレオウイルス感染。 鳥類疾患 57、321–325 (2013)。

記事 Google Scholar

Clarke, P. & Tyler, KL レオウイルス誘発アポトーシス: ミニレビュー。 アポトーシス: プログラムされた細胞死に関する国際ジャーナル 8、141–150 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Sterner, FJ、Rosenberger, JK、Margolin, A. & Ruff, MD 鳥レオウイルスの in vitro および in vivo 特性評価。 II. 2 つの鳥レオウイルス病型に感染した鶏の臨床評価。 鳥類疾患 33、545–554 (1989)。

記事 CAS Google Scholar

Van der Heide, L. 鳥レオウイルスの歴史。 鳥類疾患 44、638–641 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Songserm、T. et al. レオウイルス、大腸菌、ブロイラーから得た処理ホモジェネートのさまざまな組み合わせによる吸収不良症候群の実験的再現。 鳥類疾患 46、87–94 (2002)。

記事 Google Scholar

Matthews, R. ウイルスの分類と命名法: 1981 年 8 月、ストラスブールで開催された国際ウイルス分類委員会の会議結果の概要。Intervirology 16、53–60 (1981)。

記事 Google Scholar

Brown, F. ウイルスの分類と命名法: 1984 年 9 月に仙台で開催された国際ウイルス分類委員会の会議結果の概要。Intervirology 25、141–143 (1986)。

記事 Google Scholar

Spandidos, DA & Graham, A. 鳥レオウイルスの物理的および化学的特徴。 ジャーナル・オブ・ウイルス学、19、968–976 (1976)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Kloet, SR 4 つの二本鎖 RNA ゲノムセグメントの配列分析により、オウム目に感染する独特の遺伝子型を持つオルトレオウイルスが明らかになりました。 鳥類疾患 52、480–486 (2008)。

記事 Google Scholar

ゴールデンバーグ、D. et al. 鳥レオウイルス由来のシグマ C タンパク質の遺伝的および抗原性の特徴付け。 鳥類の病理学 39、189–199 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

シャポーリ、MR 他。 鳥レオウイルスの S1 遺伝子のクローニング、配列決定、および発現。 一般ウイルス学ジャーナル 76、1515–1520 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

Xu, W. & Coombs, KM 鳥レオウイルス L2 ゲノムセグメント配列と、コードされた RNA 依存性 RNA ポリメラーゼタンパク質の構造/機能の予測。 ウイルス学ジャーナル 5、153 (2008)。

記事 Google Scholar

Day, JM、Pantin-Jackwood, MJ & Spackman, E. 七面鳥由来レオウイルスの S1 ゲノムセグメントの配列および系統解析。 ウイルス遺伝子 35、235–242 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Spackman, E.、Pantin-Jackwood, M.、Michael Day, J. & Sellers, H. 七面鳥と鶏における七面鳥由来レオウイルスの病因。 鳥類病理学 34、291–296 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

モル、SKら。 七面鳥関節炎レオウイルスの分離と特徴付け。 鳥類疾患 57, 97–103 (2012)。

記事 MathSciNet Google Scholar

カント、A. et al. シグマ C タンパク質の配列決定によるオランダおよびドイツの鳥レオウイルスの分類。 獣医学研究 34、203–212 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

ジョーンズ、R. 鳥レオウイルス感染症。 Scientific and Technical Review (国際動物流行事務局) 19、614–625 (2000)。

CAS Google スカラー

川口 哲、野村 和也、平山 裕也、北川 徹。ニワトリ肝細胞癌細胞株 LMH の樹立と特性評価。 がん研究 47、4460–4464 (1987)。

CAS PubMed Google Scholar

Freshney, RI、『動物細胞の培養: 基本技術と特殊応用マニュアル』第 6 版。 Ch. 5、57–70 (Wiley-Blackwell、2011)。

田村和也ほか MEGA5: 最尤法、進化的距離法、および最大倹約法を使用した分子進化遺伝学解析。 分子生物学と進化 28、2731–2739 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Liu、HJ、Lee、LH、Hsu、HW、Kuo、LC、Liao、MH 鳥レオウイルスの分子進化:: S クラスのゲノムセグメントと複数の共循環系統の遺伝的多様性と再集合の証拠。 ウイルス学 314、336–349 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Martínez-Costas, J.、Grande, A.、Varela, R.、García-Martínez, C. & Benavente, J. 鳥レオウイルス S1133 のタンパク質構造と細胞接着タンパク質の同定。 ジャーナル・オブ・ウイルス学、71、59–64 (1997)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Wickramasinghe, R.、Meanger, J.、Enriquez, CE、Wilcox, GE ウイルス感染力の中和に関連する鳥レオウイルスタンパク質。 ウイルス学 194、688–696 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Bányai, K.、Dandár, E.、Dorsey, KM、Mató, T. & Palya, V. ブロイラーの発育阻害症候群に関連する新規鳥オルトレオウイルス株のゲノムコンステレーション。 ウイルス遺伝子 42、82–89 (2011)。

記事 Google Scholar

Tang, Y. & Lu, H. ペンシルベニア州で検出されたブロイラー レオウイルス野外株のゲノム特性。 感染、遺伝学、進化 31C、177–182 (2015)。

記事 Google Scholar

ベントレー、DR 他可逆的ターミネーター化学を使用した正確な全ヒトゲノム配列決定。 Nature 456, 53–59 (2008)。

記事 CAS ADS Google Scholar

Capobianchi, MR、Giombini, E. & Rozera, G. 臨床ウイルス学における次世代シーケンス技術。 臨床微生物学と感染症: 欧州臨床微生物学および感染症学会の公式出版物、19、15-22 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Desai、AN および Jere、A. 次世代シーケンシング: クリニックへの準備は整っていますか? 臨床遺伝学 81、503–510 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

AD ラドフォードら。 ウイルス学における次世代シーケンス技術の応用。 一般ウイルス学ジャーナル 93、1853–1868 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Barzon, L.、Lavezzo, E.、Militello, V.、Toppo, S.、Palu, G. 次世代シーケンス技術の診断ウイルス学への応用。 国際分子科学ジャーナル 12、7861–7884 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

クロイツェ、JF et al. 小型 RNA のディープシーケンシングによる完全なウイルスゲノム配列と新規ウイルスの発見: ウイルスの診断、発見、配列決定のための一般的な方法。 ウイルス学 388、1–7 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

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これらの鳥レオウイルスの診断および研究研究は、ペンシルベニア州農務省 (PDA)、動物衛生診断委員会 (AHDC) の研究プログラム、2013 ～ 2015 年、米国ペンシルベニア州によって資金提供されました。 ペンシルバニア養鶏産業ブロイラー/卵チェックオフ研究プログラムおよびペンシルバニア大豆委員会研究プログラム、2015年、米国ペンシルバニア州。

ペンシルバニア州立大学、ユニバーシティパーク、16802、PA、獣医学・生物医学学部、動物診断研究所

Huaguang Lu、イー・タン、パトリシア・A・ダン、エヴァ・A・ウォールナー＝ペンドルトン、リン・リン、エリック・A・ノール

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HL は主要な原稿テキストを書き、表 (1、2、S1、S2) と図 (1a、1b、2) を作成し、プロジェクトを監督し、ウイルスの分離と分子研究を支援しました。 YT は分子特性研究と配列データ分析を実施し、図 3 を作成し、表 1、2、および S2 を補助しました。 PAD と EAW は、現地調査、臨床および病理学的診断、サンプル収集を実施し、図 1(c–f) を作成しました。 LL は、LMH 細胞培養、ウイルス分離および FA テストを実行し、分子テストを支援しました (表 S1 および図 2)。EAK はサンプル処理を実行し、ウイルス分離と表 S1 を支援しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

ブロイラー鶏における鳥レオウイルス感染症の臨床徴候と病理学的病変。

(a) 生後 4 週間で重度の腱鞘炎を患ったブロイラーの症例。 (b) 脚全体に伴う腱鞘炎。 (c) 腱および腱鞘の腫れ、浮腫および出血。 (d) 全層腱断裂。 (e) 心膜炎の病変。 (f) 足根間関節付近の腱、滑膜、および関連組織の断面における慢性リンパ性形質細胞性腱滑膜炎の顕微鏡病変。

レオウイルスに感染した細胞変性効果 (CPE) 細胞に対する蛍光抗体 (FA) 検査による鳥レオウイルス (ARV) の検出。

(1a) LMH 正常細胞培養のネガティブコントロール。 (2a)、(3a)、および(4a) LMH 細胞培養における ARV 感染に特徴的な巨大な、または「ブルームのような」CPE 細胞。 (1b) 正常な LMH 細胞に対する FA 検査は陰性。 (2b)、(3b)、および (4b) ARV 感染 CPE 細胞の FA 検査陽性。 注: FA 染色された非感染 LMH 細胞シート (1b) および ARV 感染細胞シート (2b、3b、4b) は、約 1 ml の培地で対応する LMH 細胞培養物 (1a、2a、3a、4a) から採取され、次に、FA テスト用にスライドガラス上に準備します。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Lu、H.、Tang、Y.、Dunn、P. 他。 2011 ～ 2014 年、米国ペンシルベニア州における新たに出現した鳥レオウイルスの変異体と新規株の分離と分子的特徴付け。 Sci Rep 5、14727 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep14727

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受信日: 2015 年 4 月 2 日

受理日: 2015 年 9 月 7 日

公開日: 2015 年 10 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14727

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