エンテロウイルス A71 の機械感受性押し出し

Nature Microbiology volume 8、pages 629–639 (2023)この記事を引用

2913 アクセス

14 オルトメトリック

メトリクスの詳細

エンテロウイルス A71 は全身感染すると重篤な疾患を引き起こし、場合によっては生命を脅かす神経機能障害を引き起こします。しかし、ほとんどの場合、感染は無症候性であり、ウイルスが伝播のために増幅される胃腸管に限定されます。ピコルナウイルスは、細胞溶解または小胞の分泌を介して感染細胞から出ることが以前に示されています。今回我々は、共焦点顕微鏡で観察したところ、エンテロウイルスA71感染細胞全体が分化したヒト結腸オルガノイドの頂端表面から特異的に押し出されていることを報告する。化学阻害剤およびペプチド阻害剤に対する感受性の違いから、ウイルス感染細胞の押し出しは、アポトーシスによる細胞死ではなく、機械感受性イオンチャネルを介した力の感知に依存していることが実証されました。無傷のウイルスを含む押し出された細胞を単離して接種材料として使用すると、新たな感染を引き起こす可能性があります。対照的に、機械的な力の感知が抑制されると、大量の遊離ウイルスが放出されます。したがって、ウイルスに感染した生きた細胞を無傷の上皮組織から押し出すことは、宿主組織の完全性と、宿主内および宿主間でのこの糞口病原体の拡散の防止の両方に利益をもたらす可能性があります。

子孫ウイルスが感染した細胞または組織からどのように離れるかという問題は、感染した宿主全体および宿主間のウイルスの拡散を理解する上で極めて重要です。数十年にわたり、ピコルナウイルスはエンベロープを持たない、または「裸の」ウイルスとして、感染細胞の劇的な破壊を通じて厳密に溶解的に感染すると考えられていました。標準的な組織培養細胞株からピコルナウイルスが溶解放出されると、ビリオンが広範囲に拡散し、その後の感染ラウンドが開始されます。しかし、いくつかのピコルナウイルスでは非溶解性の拡散が実証されており、その間、ウイルスは細胞外小胞内に覆われた無傷の細胞からの放出を促進するために細胞内膜を適切に利用します1、2、3、4。この感染戦略の結果の 1 つは、単一のウイルス粒子が分散して拡散するのではなく、ウイルスが膜状のパケット内で一括して感染することです 5。

上皮オルガノイドモデルは、病原性傷害に対する組織特異的な反応を調べるための刺激的なツールです6、7。成体幹細胞由来の 3D 球状オルガノイドは、天然の組織に存在する細胞型の多様性を再現するために分化させることができます 8。オルガノイドは通常、その頂端面が内腔区画に面した状態で成長します。エンテロウイルス A71 (EV-A71) の頂端へのアクセスを可能にするために機械的に剪断された 2D 偏光単層またはオルガノイドは、消化管上皮の EV-A71 感染のモデル化に使用されています 9,10,11。最近、上皮の完全性を維持しながら、消化管上皮の頂端面を腸内病原体に直接提示するオルガノイドトポロジーを反転する方法が開発されました 12,13。この記事では、これらの頂端側オルガノイドを使用して、EV-A71 による上皮細胞の感染と、その後のこの組織内でのウイルス拡散のメカニズムを監視します。

我々は、上皮バリアの完全性が維持されているEV-A71感染のモデルとして、頂端アウト型消化管上皮オルガノイドを使用することに興味を持った。結腸は感染した宿主からのウイルスの出口に近いため、EV-A71の感染をよりよく理解するために結腸組織由来のオルガノイド（コロノイド）を使用することを選択しました。成人ヒト陰窩組織由来のコロノイドは、WNTおよびR-スポンジンを含む幹因子の存在下で基底膜足場上で増殖し、基底外側表面が外側を向き、内腔の頂端表面が内側を向いた幹細胞のスフェロイドを生成した。感染の5日前に、コロノイドを基底膜足場から取り出し、マトリックスの非存在下で浮遊培養に保ち、頂端表面がオルガノイドの外側（頂端アウト）になるようにオルガノイドトポロジーの逆転を誘導しました12。同時に、細胞分化を誘導する培地を適用しました。これらの頂端を出たヒトコロノイドにおいて、アクチン細胞骨格とEV-A71受容体SCARB2の構成を観察しました（図1a）。よく分化して分極したコロノイドの頂端表面には刷子縁微絨毛が含まれており、F-アクチン染色で厚いアクチンに富んだ層として容易に識別できます。 SCARB2は、分極した単層の頂端表面まで循環する内在性リソソーム膜タンパク質であり 14,15 、これらの頂端から外側のコロノイドで豊富に発現しました（図1a）。

a、頂端から出た分化した結腸上皮オルガノイドは、細胞内膜に局在するEV-A71受容体SCARB2（赤）を発現します。頂端のアクチン (白色) 微絨毛の刷子縁の完全性が見られます。 b、結腸オルガノイドをEV-A71に感染させた。ウイルス力価をプラークアッセイによって経時的にモニタリングした。 2 つの異なるコロノイドドナーを使用した 4 つの独立した実験からのデータが示されています。 c、EV-A71感染細胞は、感染48時間後に二本鎖vRNAの染色後の免疫蛍光アッセイによって観察されました。右: 左パネルの黄色の矢印で示される感染細胞の拡大図。スケールバー、10μm。

ソースデータ

感染直後から始まるウイルス増殖曲線は、EV-A71が2人の異なるヒトドナーからの分化した頂端外側コロノイドに生産的に感染することができ、培養物中のウイルスの蓄積は感染後48時間まで継続することを示しました（図1b）。その際、感染したコロノイドを固定、染色し、固定後の感染細胞で明らかな二本鎖ウイルス RNA (vRNA) の存在を共焦点顕微鏡で調べて、vRNA 複製複合体を同定しました。 vRNA複製複合体を示す点状の核および細胞質近傍の染色パターンが容易に観察されました（図1c）。不思議なことに、感染した細胞の大部分は、感染していない隣の細胞の中に孤立していました。

ウイルス収量が増加しているにもかかわらず、ウイルスの拡散が観察できないことは、感染したコロノイドの頂端表面を注意深く検査することによって正当化することができます。私たちは、無傷のコロノイドから押し出されているように見えるウイルスに感染した細胞が頻繁に観察されたことに驚きました（図2a〜c）。健康な胃腸上皮では、全細胞押出により、陰窩における幹細胞の増殖速度に合わせて既存の細胞の除去が促進され、細胞数の恒常性が維持されます。実際、非常に多くの細胞が押し出されるため、消化管上皮細胞の平均寿命はわずか 2 ～ 5 日です 16,17。 EV-A71感染細胞の押し出しの頻度が非感染細胞の押し出しを超えたかどうかを判断するために、感染細胞と非感染細胞の両方が同じEV-A71感染コロノイドから押し出しを受ける頻度を定量化しました（図2d、eおよび補足表1）。）。感染したコロノイドを固定し、染色し、共焦点顕微鏡で検査しました。個々の細胞は、(1) 感染または非感染、および (2) 押し出しまたは非押し出しに分類されました。細胞の核がオルガノイドの頂端境界を越えた場合、細胞はオルガノイドからはみ出していると定義され、皮質アクチンをファロイジンで染色することで可視化されました。調べた48時間の時点で、感染細胞の40％が押し出されていたのに対し、非感染細胞はわずか1％でした（図2dおよび補足表1）。同様に、感染細胞はオルガノイド内の細胞の0.4％のみを構成しましたが、押し出している細胞の25％を構成しました（図2eおよび補足表1）。これらのデータは、感染細胞がランダムな偶然によって予想されるよりもかなり高い頻度でコロノイドから押し出されていることを示しています。

a〜c、感染したコロノイドを感染後48時間で固定し、二本鎖vRNAを染色しました。ｄ、感染細胞は、非感染細胞よりも高い頻度でコロノイドから押し出された。個々のオルガノイドから押し出される感染細胞または非感染細胞の割合が小さな円で示されます。各実験においてすべてのオルガノイドにわたって押し出される細胞の割合は、個々のコロノイドと同じ色の三角形として示されます。実験ごとに少なくとも 10 個のオルガノイドが定量化されました: **P < 0.01; 対応のある両側 t 検定、N = 3 実験。 e. 感染した押し出している細胞と非押し出している細胞のパーセンテージを同様に測定しました。押し出された細胞のうち、より高い割合が感染していました。 **P < 0.01; 繰り返し測定、Tukey の多重比較検定による一元配置分散分析、N = 3 回の実験。 dおよびeでは、グラフに示されている生の細胞数を補足表1に示します。f、EV-A71感染コロノイドを、杯細胞のマーカーであるMuc2発現について染色しました。矢印は感染細胞を示します。矢印はgに示すゴブレットセルを示します。 g、Muc2発現杯細胞。 h、i、ビリン発現により結腸細胞が識別されます。ビリンは頂端に局在し、アクチンに富んだ微絨毛の刷子縁と重なっています。個別の個々の細胞が表示されます。 j、k、EV-A71感染コロノイドをVillin発現について染色した。 l、代表的な押し出される感染細胞が示されている。 m、未感染上皮における標準的な細胞押し出しの段階が示されています。 n、o、ポリオウイルス 1 型 (Mahoney) に感染した細胞が回腸オルガノイドから押し出されることが免疫蛍光によって観察されました。 o は、n で強調表示された個々のセルを示します。スケールバー、10μm。 d および e では、水平バーと誤差バーは平均値 ± SD を表します。

ソースデータ

コロノイドの許容細胞タイプを特定するために、吸収性結腸細胞と杯細胞によってそれぞれ発現される Villin1 と Muc2 を標的とする抗体を使用して免疫染色を実行しました（図 2f-k）。どちらの細胞型も、胃腸上皮における EV-A71 感染に関与していることが以前に示唆されています 10,11。我々の観察は、このモデルでは杯細胞ではなく吸収性結腸細胞が主に感染した細胞型であることを示唆しています。この発見は、杯細胞がより豊富に存在する上皮における杯細胞の感染を排除するものではありません。

我々は、標準的な全細胞押し出しの段階を彷彿とさせるいくつかの異なる状態にある感染細胞を観察しました（図2l、m）。細胞の押し出しは、上皮バリアの完全性を維持しながら、望ましくない細胞の除去を可能にする高度に調整されたプロセスです18、19。標準的な押し出し中、押し出しに運命付けられた細胞とその隣接細胞は、押し出される細胞の基部を囲むように細胞骨格を再配置します。これらのアクチン-ミオシン環は先端方向に収縮し、「巾着紐」機構と呼ばれるものによって押し出される細胞を絞り出します（図2n）20。同時に、上皮の完全性を維持するために、押し出している細胞の下の新しい隣接細胞間で密着結合が再形成されます 21,22。セルの移動と新しい隣接セルの形成は、約 40 分間にわたって発生します。押し出された細胞は、隣接する細胞から剥がれて浮遊する前に、さらに 40 分間上皮にくっつきます 20,23。図2lに示すように、押出の初期段階と後期段階の両方に一致する状態の感染細胞を観察しました。左側では、感染細胞がオルガノイド内に埋め込まれており、感染細胞の下で凝縮したアクチン層に囲まれているのが見られます。中央の画像は、押し出された細胞が再形成された無傷の頂端面とまだ接触していることを示しています。右側の完全に分離された感染細胞は、感染オルガノイドと並んで浮遊しているのが観察されました。

感染細胞の押し出し現象がEV-A71に特異的であるかどうかを調べるために、エンテロウイルスCの関連種のメンバーであるポリオウイルスに感染した細胞を調べた。小腸の回腸組織および結腸組織に由来するオルガノイドでは、押し出されたポリオウイルス感染細胞が容易に観察されました（図2n、oおよび拡張データ図1）。我々は、複数のエンテロウイルスが、細胞全体の押し出しによる胃腸オルガノイドからの感染細胞の排出を促進することを示唆しています。我々はさらに、EV-A71感染細胞の押し出しが頂端側オルガノイドの上皮構造に特異的であるかどうかを疑問視した。しかし、感染細胞の押し出しは、対照的な側底外側コロノイドで容易に観察されました（拡張データ図 2）。

感染細胞の押し出しのタイミングを特徴付けるために、感染の最初のラウンド中にコロノイド内の感染細胞を視覚化しました（拡張データ図3および補足表2）。我々は、感染細胞が感染後早くて 5 時間、遅くて 9 時間で押し出される可能性があり、押し出された感染細胞にはすべての時点で豊富な vRNA が含まれていることを観察しました。したがって、感染動態における細胞間の違い 24 がおそらく排出のタイミングに寄与していると考えられます。コロノイド内の感染細胞の数は、感染後 5 時間から 7 時間で大幅に増加しましたが、培養物全体の感染性ウイルスの量が増加し続けたにもかかわらず、その後は大幅に減少しました（図 1b）。感染細胞が感染後 7 時間から 9 時間の間に主に脱落することは、コロノイド内で細胞間伝達が観察されないことと一致しています。

無傷な上皮からのアポトーシス細胞の押し出しは、当初、上皮バリアを損なうことなく死にかけている細胞を除去する手段として記載されていました20。 EV-A71 感染がいくつかの細胞型でアポトーシスを引き起こす可能性があることを考慮して、アポトーシスシグナル伝達がコロノイド内の感染細胞の押し出しを引き起こすかどうかをテストしました。蛍光発生基質（CellEvent、ThermoFisher）を利用して、活性カスパーゼ3および7を発現する細胞を視覚化しました。感染したオルガノイドを基質とインキュベートし、固定し、二本鎖RNAを染色し、共焦点顕微鏡で検査しました（図3a〜e）。非感染の押し出された細胞の約半分はカスパーゼ 3/7 陽性であり、腸上皮における細胞押し出しの正常な機能と一致していました 29。ただし、感染して押し出している細胞のかなり低い割合がカスパーゼ3/7陽性でした（図3fおよび補足表3）。さらに、感染して押し出している細胞の核は通常無傷であり、アポトーシス細胞に特徴的な凝縮および断片化された核を示さなかった。これらのデータは、アポトーシスストレスが感染細胞の押し出しを引き起こさないことを主張しています。

感染したコロノイドは、感染の 48 時間後に免疫蛍光共焦点顕微鏡によって視覚化されました。カスパーゼ 3 および 7 の活性は、蛍光発生基質を使用して視覚化されました。 a, 押し出された細胞を含む個々の感染オルガノイド。 b、aの単一の未感染のアポトーシスを押し出した細胞の拡大図。 c、aの2つの感染した非アポトーシスの押し出し細胞の拡大図。 d. 押し出された細胞を含む個々の感染オルガノイド。 e、dの2つの押し出しセルの拡大図。 f、アポトーシスを起こした感染押出細胞と非感染押出細胞の割合を定量化し、各実験の全体値を三角形で示します。各色は独立した実験を表し、個々のオルガノイドの測定値は小さな円で示されます。 *P < 0.05; 対応のある両側 t 検定、N = 3。水平バーとエラーバーは平均値±sdを表します。このグラフに表される生の細胞数は補足表3に表示されます。スケールバー、10μm。

ソースデータ

アポトーシスまたはパイロトーシスの細胞死に加えて、胃腸上皮からの細胞の押し出しは、過密による細胞への機械的力によって引き起こされる可能性があります 30,31。機械感受性イオンチャネル Piezo1 は、アポトーシス細胞の押し出しには何の役割も果たしていませんが、細胞密集ストレスを感知して応答し、細胞の押し出しを引き起こします 29。私たちは、感染細胞の生体力学的特性の変化が Piezo1 によって感知され、感染細胞の力に依存した押し出しが引き起こされる可能性があると仮説を立てました。この仮説を検証するために、我々は感染したコロノイドを、Piezo1を含む機械感受性イオンチャネルの活性を阻害するクモ毒ペプチドであるGsMTx4で処理した(参考文献32、33)。また、アポトーシス細胞の押し出しを減らすことが知られている汎カスパーゼ阻害剤である Z-VAD-FMK の効果も評価しました 23。最後に、最初のトリガーに関係なく、アクチン-ミオシンの再配置が細胞の押し出しに重要であることを考慮して、すべての細胞押し出し機構の阻害のポジティブコントロールとしてミオシンII阻害剤パラニトロブレビスタチン34の効果をテストしました35、36（図4e））。

EV-A71に感染したオルガノイドは、さまざまな押出機構に関与する細胞因子を阻害できる化合物に曝露された。 a〜d、感染したオルガノイドを0.5％DMSOビヒクルコントロール（a）、50μMパラニトロブレビスタチン（b）、100μM Z-VAD-FMK（c）または20μM GsMTx4（d）に曝露しました。オルガノイド内の感染細胞は、共焦点顕微鏡により視覚的に検査されました。黄色の矢印は、代表的なオルガノイドの感染細胞を示します。スケールバー、10μm。 e、ブレビスタチンはアポトーシス性と機械感受性の押し出しの両方を阻害し、Z-VAD-FMKはアポトーシスの押し出しのみを阻害し、GsMTx4は機械感受性の押し出しのみを阻害します。 f、感染の7時間後に押し出された感染細胞の割合を列挙した。各色は独立した実験を示しています。実験ごとに押し出される感染細胞の全体的な割合を三角形で示し、各オルガノイドの測定値を小さな円で示します。 **P < 0.01; NS、重要ではありません。ダネット多重比較検定を用いた反復測定一元配置分散分析、N = 3.g、感染懸濁オルガノイド培養物から感染後 7 時間で定量化されたウイルス力価は、ウイルス収量に対する薬物処理の有意な効果を示さない。ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析を繰り返し測定し、N = 3 の独立した感染を測定します。 f と g では、水平バーと誤差バーは平均値 ± SD を表します。

ソースデータ

EV-A71による2時間の感染後、感染の単一サイクルの残りの間、コロノイドを上記の化合物で処理しました（図4a〜d）。コロノイドから押し出される感染細胞の割合を各条件下で定量化しました（図4f）。予想通り、オルガノイドから押し出される感染細胞の割合は、ブレビスタチンの存在下で減少し、アポトーシスの押し出しのみを阻害する Z-VAD-FMK の影響を受けませんでした。しかし、機械感受性イオンチャネル阻害剤GsMTx4の存在下で押し出される感染細胞の割合の顕著な減少が観察されました（図4f）。これがウイルス増殖の阻害による可能性を排除するために、ウイルス収量に対するすべての化合物の影響を評価しましたが、いずれも変化しませんでした（図4g）。これらの結果は、EV-A71に感染した生きた細胞の排除に重要なのは、GsMTx4が標的とする機械感受性イオンチャネルの力感知活性であることを主張する。

押し出された感染細胞が胃腸管内でウイルスの拡散源となるかどうかを判断するために、押し出された細胞（細胞）を分別沈降法（方法）によって収集し、その中のウイルスの量を測定しました。洗浄ステップにより細胞画分から無細胞ウイルスが効率的に除去されたことを確認するために、106 プラーク形成単位の外因性ウイルスを一連の (細胞 + 培地) サンプルにスパイクしました。スパイクインされたウイルスは、細胞 + 培地サンプルのウイルス力価を大幅に増加させました (図 5b)。しかし、細胞内のウイルス力価は外因性ウイルスのスパイクインによって変化せず、洗浄により潜在的な汚染フリーウイルスを首尾よく除去したことが実証されました。さらに、図 5c に示すように、押し出された細胞画分には、無細胞培地よりも感染性ウイルスが有意に多く存在しました。

a、EV-A71 に感染したコロノイド培養物を感染後 8 時間で収集し、成分を分別沈降によって収集しました。 b. 押し出された細胞の洗浄の有効性を評価するために、106 PFU の外因性遊離ウイルスを細胞 + 培地サンプルにスパイクインしました。ウェル全体 (空白のバー)、細胞 + 培地 (小さな点線のバー)、および細胞 (大きな点線のバー) を含む画分を凍結融解およびプラークアッセイに供しました。 Holm-Šídák 多重比較検定による反復測定一元配置分散分析。 NS、重要ではありません。 c、細胞および培地におけるウイルスの分布。比率対応両側 t 検定。 d、細胞および培地画分からのウイルスの安定性。収集した画分を 37 °C で指定の時間インキュベートし、凍結融解を繰り返した後、プラークアッセイを行いました。ウイルスの量は、インキュベーション前の c の値に正規化されます。ガイサー・グリーンハウス補正を使用した二元配置分散分析。 e、無傷の押し出された細胞画分および細胞の最終洗浄からの遊離ウイルスを使用して、RD細胞単層を感染させた。二次感染を開始してから 1 時間後および 16 時間後に、感染した RD 細胞のウイルス力価を測定しました。対応のある比 (細胞 - 細胞、洗浄液 - 洗浄液) と対応のない比 (洗浄液 - セル)、両側 t 検定。破線は検出限界を示します。 f、細胞画分および細胞の最終洗浄液からの遊離ウイルスを使用して、新しいコロノイドを感染させた。 2時間後および16時間後、ウェル全体の画分中のウイルスの量をプラークアッセイによって測定しました。 eに記載されている統計的テスト。 g、h、二次感染したRD細胞（g）および16時間後に細胞を接種したオルガノイド（h）の共焦点顕微鏡。スケールバー、10μm。 h、いくつかの感染細胞を含む二次感染オルガノイド。下: 黄色の矢印で示された、二次感染して押し出された細胞の直交断面。 i、EV-A71感染コロノイド培養物をGsMTx4またはビヒクルで処理し、8時間後に画分を収集しました。 GsMTx4 処理により、押し出された細胞内の感染性ウイルスの量が減少しましたが、培地内の感染性の遊離ウイルスの量は増加しました。多重比較のためのホルム・シダック補正を使用した複数の対応のある両側 t 検定。 b〜fおよびiでは、独立した感染を3回実行した代表的な実験が示されています。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001; 表されるデータは平均値±標準偏差です

ソースデータ

押し出された細胞が押し出し後にどれだけ長く生存していたのかを決定するために、48 時間後の細胞のアポトーシス状態をモニタリングしました。その時点で、感染および非感染の両方の押し出された細胞の大部分はカスパーゼ 3/7 陽性であり (拡張データ図 4)、これはウイルス感染の結果として押し出された細胞が最終的に剥離誘導性のアポトーシス細胞死を起こすことを示唆しています。これらの瀕死の押し出された細胞内の滞留が常駐ビリオンを損傷するかどうかをテストするために、図5cに示す細胞および培地の調製物を37℃でインキュベートしました。プラークアッセイの前に、すべてのサンプルを凍結融解を繰り返して細胞を溶解しました。 48時間の経過にわたって、細胞内に存在するウイルスは、培地中の遊離ウイルスと同様に安定性を保持しました（図5d）。したがって、結腸上皮から排出される感染細胞には、安定した感染性ウイルスが含まれています。

押し出された細胞自体が感染性であるかどうかを解明するために、感染したコロノイドから細胞画分を調製し、二次感染の接種材料として使用しました（図5e、f）。二次感染した横紋筋肉腫 (RD) 細胞単層と未感染コロノイドの両方におけるウイルス増殖を、感染直後と感染 16 時間後の力価を比較することによって調べました。残っている遊離ウイルスから細胞を効果的に単離するための対照として、３回の洗浄のうちの最後の上清も接種材料として使用した。以前に感染したオルガノイドから押し出された細胞に感染した培養物では、感染直後に豊富なウイルスが存在し（図5e、f）、インキュベーション時に顕著な増加が観察されました。重要なことは、16時間後、押し出された細胞に感染した培養物中のウイルスの量は、洗浄上清に感染した培養物中のウイルス量よりも有意に多く、残存する無細胞ウイルスではなく押し出された細胞の存在が高いウイルス量の原因であることを示している。。共焦点顕微鏡検査により、二次感染したRD単層およびコロノイド内の感染細胞の存在が確認されました（図5g、h）。したがって、押し出されたウイルス含有細胞は、RD 単層と頂端から出た分化したコロノイドの両方に感染します。

押出が阻害されたときにコロノイド上皮層に保持されているウイルスと細胞の運命を決定するために、コロノイドをEV-A71に感染させ、ウェル全体、オルガノイド、細胞および培地画分（図5a）を示差沈降によって収集しました（方法、拡張データ図 5 および補足表 4)。プラークアッセイの前に、サンプルを凍結融解を繰り返して細胞内ウイルスを放出させました。予想通り、GsMTx4 による処理による力感知の阻害は、ウェル全体の画分で証明されるように、ウイルス全体の増殖に影響を与えませんでしたが、押し出された細胞画分ではウイルスの量が大幅に減少しました。たとえ感染細胞の放出がブロックされたとしても、無傷のオルガノイド内の感染性ウイルスの量は、GsMTx4 処理によって増加しませんでした。代わりに、押し出しがブロックされた場合、培地画分で有意に多くのウイルスが観察されました（図5i）。上皮層から細胞が押し出されることで、本来起こるであろう結果、つまり無細胞ウイルスの放出が防止されると我々は推測しています。

感染した細胞は、アポトーシス、オートファジー、炎症性メディエーターの合成などの生来の細胞反応を引き起こす、さまざまな代謝ストレス、酸化ストレス、ミスフォールディングストレスを経験します。成功したウイルスは、ウイルスの複製を促進するために、これらの反応の多くを阻害または破壊します。今回我々は、EV-A71が機械感覚シグナル伝達経路にも影響を与えることを報告する。結腸オルガノイドの分極した細胞では、EV-A71 感染細胞が結腸内腔に対応する頂端の細胞外環境に優先的に押し出されます。このプロセスは、腸上皮から感染細胞を排除することにより宿主にとっても、ウイルス集団にとっても有益である可能性があり、ウイルス集団の集団的排出により宿主間感染が促進される可能性がある。 EV-A71 に感染したマウスでは、腸絨毛の短縮が以前に観察されています 37,38。他の疾患における絨毛短縮は、押し出しによる細胞損失率の増加によって引き起こされます 39。したがって、オルガノイドからの感染細胞の機械感受性排除は、これらの in vivo 観察と一致しており、説明できる可能性があります。

この研究では、極性化したヒトコロノイドからの EV-A71 感染腸細胞の押し出しが、機械感受性イオンチャネルの阻害剤である低分子ペプチド GsMTx4 によって妨げられることを示しました 33。これらのデータは、力の感知が感染細胞の押し出しのトリガーであることを示唆しています。培養された分極した単層および腸上皮では、力感受性イオンチャネル Piezo1 が細胞密度恒常性のセンサーとして機能することが知られています 29,40。上皮が過密になると、恒常性のある細胞数が再確立されるまで、Piezo1 は生きている非アポトーシス細胞の押し出しを誘導します 29。ピエゾタンパク質は、プロペラ状のアームと中央の Ca+2 透過性細孔を備えた、原形質膜に埋め込まれたホモ三量体です 41。機械的な力による原形質膜の変形により、アームが再配置され、孔が開く構造変化が誘発されると考えられています 41。我々は、Piezo1 が、ここで報告されている感染細胞の力駆動による押し出しの有力な候補であると仮定します。

この研究では、ヒトコロノイドから押し出された感染細胞が丸く、頂端面のアクチン微絨毛を失っていることを観察しました。対照的に、コロノイド内の感染細胞は、感染していない隣接細胞とサイズと形状が類似しているように見えました。エンテロウイルスは、すべての細胞骨格要素を含む宿主細胞成分の全体的な再構成を引き起こすことが知られています 42、43、44。実際、劇的な細胞骨格の再構成は、多くのウイルスによって引き起こされる「細胞変性効果」のよく使われる説明に大きく貢献しています45。膜張力と細胞骨格結合の両方の低下が、Piezo1 の活性化に関与していると考えられています 41,46,47。ウイルス感染によって誘発される細胞骨格の破壊は、EV-A71 感染細胞の生体力学的特性を変化させ、Piezo1 の活性化とそれに続く押し出しを引き起こす可能性があります (拡張データ図 6)。

機械的な細胞競合による感染細胞の除去は、感染組織における局所的なウイルスの拡散を制限することで宿主に利益をもたらす可能性がある。さらに、排出が阻止されると細胞外ウイルスの増加が観察され、オルガノイド内に強制的に残された感染細胞が溶解または異常な分泌を通じてウイルスを培地に放出することを示唆しています。感染細胞が溶解寸前にある場合、その押し出しは上皮バリアの維持、炎症の軽減、またはその両方によって宿主に利益をもたらす可能性があります (図 6)。

結腸から消化管内腔へ押し出されたEV-A71感染細胞は、糞口感染において重要な役割を果たしている可能性がある。感染性ウイルスを保持する細胞が押し出されるとき、子孫ビリオンは腸を通過し、押し出された生きた細胞内の便中に排泄されると予想されます。細胞内では、ビリオンは粘膜抗体などの腸内容物から保護されている可能性があります。細胞内でビリオンが束ねられると、集団感染がさらに促進され、ウイルスゲノムの多様性が維持される可能性があります。より迅速なウイルス除去や感染に対する耐性の向上など、生体内での感染細胞の押し出しによる宿主の利点の可能性については、さらなる研究が必要な未解決の興味深い疑問が残っています。

押し出された細胞は、胃腸組織のある領域から同じ宿主内のより遠位の領域へ、または別の宿主へウイルスが拡散する手段としても機能する可能性があります（図6）。われわれは、EV-A71に感染した細胞自体が、細胞単層と未感染のオルガノイドの両方に感染性があることを発見した。押し出された細胞内で結腸を通過すると、粘膜抗体などの管腔内容物からビリオンが保護される可能性があります（図6）。このような一括ウイルス送達は、濃縮されたウイルスの伝播と細胞内ウイルス準種集団の複雑さの維持により、いくつかの結果をもたらす可能性があります5、48、49、50。

私たちの発見は、さまざまな機構を介した感染細胞の制御された排出によって細胞内病原体が上皮層から除去できるという一連の証拠をさらに強化するものである。ロタウイルス、レオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サルモネラ菌はすべて、単一の感染細胞においてパイロトーシスまたはアポトーシスによる細胞死を引き起こし、その後押し出されます31、51、52、53、54。対照的に、リステリアウイルスと麻疹ウイルスは両方とも大量の脱落を誘導し、多数の生きた感染細胞が分極した上皮の上に凝集する大きな丘を形成します36、55、56。ここで説明した感染細胞の力依存性単細胞押し出しという独特の現象は、まだ特定されていない追加の細胞内病原体による感染を伴う可能性があります。

要約すると、これらの発見は、機械感受性イオンチャネル活性によって開始されるウイルス感染細胞の生きた押し出し現象を特定する。機械感受性の押し出しは、上皮組織から感染細胞の排除を開始することにより、重要な自然免疫機能に役立つ可能性があります。さらに、押し出された細胞がさらなるウイルス感染を引き起こす可能性があることを考えると、ウイルス感染細胞の脱落は、これまで評価されていなかった糞口感染の手段として機能する可能性があります。

オルガノイドは、参考文献に記載されている原理に従って生成されました。 8. 消化管上皮オルガノイドは、スタンフォード大学の Calvin Kuo の研究室によって、健康な成人の消化管組織生検の解剖を通じて以前に生成されました 13。これらは患者の同意とスタンフォード大学治験審査委員会の承認を得て、スタンフォード組織バンクによって匿名化され入手されました。組織生検は、年齢と性別に関する患者情報を特に収集することなく取得され、特定の対象を絞った登録や計画された登録は行われませんでした (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719301457?via%3Dihub)。

維持のために、オルガノイドを、24 ウェル組織培養処理プレート内の液滴として Cultrex 還元成長因子基底膜マトリックス II 型 (BME、マトリゲルと同等) 内に播種しました (ウェルあたり 40 μl)。 BME を 37 °C で 10 分間インキュベートして重合させ、その後増殖培地を BME の上に重ねました。増殖培地は、Advanced Dulbecco 改変イーグル培地 (DMEM)/F12、1 mM HEPES、1 × Glutamax、1 × B27 (ビタミン A なし)、1 mM N-アセチル-システイン (腸および結腸サンプルのみ)、10 nM で構成されます。ガストリン、50 ng ml-1 上皮成長因子、10 mM ニコチンアミド、500 nM A83-01、10 μM SB202190、100 ng ml-1 FGF10 (胃サンプルのみ)、および 50% L-WRN 馴化培地 (Wnt3a を含む) R-スポンジン 3 およびノギン）。 L-WRN 馴化培地は L-WRN 細胞から調製されました 57。 L-WRN 馴化培地を等分して、長期保存のために -80 °C で凍結しましたが、オルガノイドの成長に対する悪影響は観察されませんでした。必要に応じて、増殖培地を 1 ～ 4 日ごとに交換しました。

継代するには、オルガノイドを TrypLE Express 中で 10 ～ 15 分間、37 °C で単一細胞に解離させ、ピペッティングによって手動で破砕し、その後トリプシンを FBS で不活化しました。氷上で、細胞を70μm孔のナイロンメッシュセルストレーナーで濾過し、細胞の大きな塊または未解離のオルガノイドを除去しました。 Countess II Cell Counter (ThermoFisher) で細胞を計数し、ウェルあたり 5 × 103 ～ 1.5 × 104 細胞の濃度で BME に再播種しました。最初の継代後 2 ～ 3 日間、剥離を介した細胞死を防ぐために、10 μM Y27623 および 250 nM CHIR99021 を増殖培地に含めました。必要に応じて、オルガノイドを 4 ～ 10 日ごとに継代しました。使用したすべてのオルガノイドは、マイコプラズマ汚染が存在しないことを確認するために、Myco-Sniff (MP Biomedicals) でテストされました。

4 ～ 7 日間の増殖後、オルガノイドをマトリゲルから取り出し、頂端面を露出させるために極性を反転するように誘導しました 12。オルガノイドをリン酸緩衝食塩水 (PBS) 中の 5 mM EDTA 中で 4 °C で 40 分間インキュベートし、DMEM で洗浄し、分化培地に再懸濁しました: Advanced DMEM/F12、1 mM HEPES、1× Glutamax、1× B27、 1 mM N-アセチル-システイン (腸および結腸サンプルのみ)、10 nM ガストリン、50 ng ml-1 上皮成長因子、10 ng ml-1 ノギン、500 nM A83-01、5 μM γ-セクレターゼ阻害剤 IX ( DAPT としても知られ、結腸サンプルのみ）、100 ng ml-1 FGF10（胃サンプルのみ）および 10 μM Y27623。浮遊培養中のオルガノイドを超低付着プレートまたはフラスコ (Corning Costar) に播種し、実験使用前に分化と極性反転を完了するために 37 °C で 5 日間インキュベートしました。

Peter Sarnow の研究室から贈られた RD 細胞を、10% ウシ胎児血清 (Omega Life Sciences) を添加した DMEM (Hyclone; 4,500 mg l-1 グルコース、4 mM l-グルタミンおよび 1 mM ピルビン酸ナトリウム) で培養しました。 1× 非必須アミノ酸 (MEM NEAA、Gibco) および 1× ペニシリン - ストレプトマイシン (Gibco)。 RD 細胞は 37 °C、5% CO2 で増殖させました。 HeLa 細胞は、10% ウシ胎児血清 (Omega Life Sciences) および 1 × ペニシリン - ストレプトマイシン (Gibco) を添加した DMEM (Hyclone; 4,500 mg l-1 グルコース、4 mM l-グルタミンおよび 1 mM ピルビン酸ナトリウム) 中で培養しました。 RD 細胞も HeLa 細胞も、国際細胞株認証委員会 (https://iclac.org/databases/cross-contaminations/) が管理する既知の誤認細胞株のリストには載っていません。細胞株の認証に関する情報は、補足情報に記載されています。

EV-A71 株 Taiwan/4643/98 は、Jen-Ren Wang の研究室が RD 細胞を使用して作製した感染性クローンから増幅されました 58。使用したウイルス株の完全な相補的 DNA 配列は、GenBank アクセッション番号 JN544418 で見つけることができます。 RD 細胞での 2 回目のウイルス継代からのウイルスストックを生成し、感染に利用しました。ウイルス力価は、0.3% (w/v) アガロースオーバーレイを使用した RD 細胞のプラークアッセイによって決定されました。３日後にプラークを２％ホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色することによって数えた。ポリオウイルス 1 型マホニーは感染性クローンから増幅され、HeLa 細胞内で増幅されました。ウイルス力価は、1.2% (w/v) アビセルオーバーレイを使用した HeLa 細胞のプラークアッセイによって決定されました。２日後にプラークを同様に固定し、計数のために染色した。

分化した頂端側オルガノイド（分化および極性反転後 5 日）を EV-A71 株 4643 に感染させました。RD 細胞は EV-A71 感染に対して非常に感受性が高いため、RD 細胞によって定義される感染多重度は、より希薄な感染に相当します。オルガノイドでは。したがって、オルガノイドを高い感染多重度（MOI、細胞当たり620 PFU）に曝露して、オルガノイド当たり5個以下の細胞が感染する感染を確立した。結腸、胃および十二指腸組織から頂端側オルガノイドを調製し、EV-A71 に感染させた。これら 3 つの組織の中で、コロノイドが最も強く感染しました (図 1b および拡張データ図 7)。

感染前に懸濁液中のオルガノイドを残骸から分離するために、オルガノイドを 15 ml コニカルチューブに収集し、ベンチトップ (1g) で 5 ～ 10 分間重力によってペレット化させました。上清を廃棄し、ペレット化したオルガノイドをDMEMで1回洗浄した。重力ペレット化により、単一細胞による汚染は非常に低くなりました (拡張データ図 5 および補足表 4)。このオルガノイド懸濁液のアリコートを取り出し、TrypLE Express で解離させ、Countess II Cell Counter (ThermoFisher) で計数して、MOI 計算のためにオルガノイド懸濁液中の細胞を数えました。３回の感染を行う実験では、オルガノイド懸濁液を３つの円錐管に分割した。オルガノイドを 300 g で 3 分間ペレット化し、適切な量のウイルスストック (3.7 × 108 PFU ml-1) に再懸濁し、超低付着プレートに移し、37 °C、5% CO2 で 2 時間インキュベートしました。インキュベーション後、オルガノイドをDMEM中で300gで3分間遠心分離して3回洗浄した。 3回目の洗浄後、オルガノイドを温かい分化培地に再懸濁し、超低付着組織培養プレートに播種しました。次に、該当する場合には薬理学的治療が追加されました。感染したオルガノイドは、実験の終点まで 5% CO2、37 °C でインキュベートされました。全体的なウイルス力価を定量する実験では、オルガノイド懸濁液全体が収集され、サンプルはプラークアッセイの前に細胞を溶解するために 3 回の凍結融解サイクルにさらされました。

分化した側底外側コロノイドをEV-A71に感染させる実験では、コロノイドを増殖培地中で5日間増殖させ、BMEゲル足場から除去せずに感染前に5日間分化させた。感染当日、5 mM EDTA中で40分間インキュベートすることにより、コロノイドを重合BMEマトリックスから除去した。 DMEMで1回洗浄した後、コロノイドをEV-A71接種材料（細胞あたりMOI 1,300 PFU）を含む冷分化培地に再懸濁し、浮遊培養における極性の逆転を防ぐために20％（v/v）BMEを補充しました。 EV-A71 の存在下でコロノイドを超低付着組織培養プレートに播種し、固定前に 5% CO2、37 °C で 8 時間インキュベートしました。

ポリオウイルス感染については、EV-A71感染について上記した方法を用いて、分化した頂端側回腸および結腸オルガノイドを感染させた。回腸オルガノイドを細胞あたり 10 PFU の MOI で感染させ、22 hpi で固定しました。結腸オルガノイドを細胞あたり 1 PFU の MOI で感染させ、42 hpi で固定しました。

オルガノイドを、100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) 中の 2% パラホルムアルデヒドで少なくとも 30 分間固定し、PBS で洗浄しました。オルガノイドは、ブロッキング/透過化緩衝液(3%ウシ血清アルブミン、1%サポニンおよび0.02%アジ化ナトリウムを含むPBS)中で抗体および/または染色液とともに穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートすることによって染色した。染色されたオルガノイドを PBS で 3 回洗浄し、Vectashield 封入剤 (Vector Laboratories、H-1000) を使用してスライドガラスにマウントし、真空グリースを使用してカバーガラスを貼り付けました。オルガノイドは、Zen 2009 ソフトウェア (Carl Zeiss) を備えた LSM 700 共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss) で油浸対物レンズを使用し、倍率 40 倍または 63 倍で画像化しました。オルガノイドの 3D レンダリングは、Volocity 3D 画像解析ソフトウェア (PerkinElmer バージョン 5.3) を使用して生成されました。

オルガノイドを 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI; Life Technologies、D1306) および Alexa Fluor 660 ファロイジン (Invitrogen、カタログ番号 A22285) で染色して、核とアクチンを視覚化しました。一次抗体の希釈は以下の希釈で実施した：マウス抗ｄｓＲＮＡＩｇＧ２ａカッパ鎖抗体（Ｊ２）ＳＣＩＣＯＮＳ（ＮｏｒｄｉｃＭＵｂｉｏより入手）ｃａｔ．いいえ。 10010200、RRID: AB_2651015 (1:500)、ウサギ抗 LIMP2/SCARB2 組換えモノクローナル抗体 (22H6L14) ThermoFisher cat。いいえ。 703037; RRID: AB_2734813 (1:100)、ウサギ抗 Muc2 ポリクローナル抗体 (H-300) SCBT 猫。いいえ。 sc-15334 RRID: AB_2146667 (1:200) およびウサギ抗 VIL1 IgG 抗体 Sigma Aldrich cat。いいえ。 HPA006885; RRID: AB_1080564 (1:100)。二次抗体の希釈は 1:500 希釈で実行されました。以下の二次抗体を使用しました: ヤギ抗マウス IgG (H + L) 交差吸収二次抗体、Alexa Fluor 488 Invitrogen cat。いいえ。 A11001; RRID: AB_2534069; ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 Invitrogen cat。いいえ。 A11008; RRID: AB_143165; ヤギ抗マウス IgG (H + L) 交差吸収二次抗体、Alexa Fluor 555 Invitrogen cat。いいえ。 A21422; RRID: AB_2535844; ヤギ抗マウス IgG (H + L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 594 Invitrogen cat。いいえ。 A11005; RRID: AB_2534073; ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 594 Invitrogen cat。いいえ。 A11012; RRID: AB_2534079; ウサギ抗マウス IgG (H + L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 Invitrogen cat。いいえ。 A11059; RRID: AB_142495。同じオルガノイド染色手順で複数の二次抗体が使用された場合、使用された二次抗体は同じ宿主種 (ヤギ) で生成されたものです。カスパーゼ 3/7 活性を視覚化するために、CellEvent カスパーゼ 3/7 グリーン検出試薬 (Invitrogen、C10723) を 24 時間の感染後に生きたオルガノイドに 10 μM で添加し、その後オルガノイドを 48 hpi で固定し、上記のように染色しました。オルガノイドから完全に押し出された単一細胞は、上記の無傷のオルガノイドと同じ方法で染色および画像化されました。ただし、これらの実験では倍率 20 倍の乾式対物レンズを使用しました。

オルガノイド画像は、Volocity 3D 画像解析ソフトウェア (PerkinElmer) を使用して表示され、各オルガノイドの 3D 視覚化が得られました。押し出している、アポトーシスを起こしている、および/または感染していると考えられるオルガノイド内の細胞を手動で数えました。押し出し細胞は、オルガノイド微絨毛の刷子縁を横切った核を持つオルガノイドに付着した細胞によって定義されました。すべての細胞の計数が必要な実験では、単一の Z 平面で各オルガノイド細胞の核を捕捉するために、6 μm の Z スタック間隔で DAPI をイメージングすることにより、各オルガノイドの細胞の総数が数えられました。 Volocity を使用して、2D 核定量化機能を使用してこれらの個々の Z 平面画像から個々の核を定量化しました。

関連する実験では、残りの非押し出し細胞または未感染細胞の定量は、各オルガノイドの細胞の総数から各グループで手動でカウントされた細胞の数を差し引くことによって計算されました。

完全に押し出されたセルを検査する実験では、1.8 μm 間隔の Z スタックを使用した画像の 3D レンダリングから個々のセルが識別されました。 Volocity 3D 画像解析ソフトウェア (PerkinElmer) を使用して個々の細胞を特定しました。最初に Find Objects 定量化機能を使用して核を特定し、Dilate Objects 定量化機能を 2 回繰り返し使用して各核を囲むようにオブジェクト領域を増加させ、各チャネルの信号強度を測定しました。オブジェクトの測定機能を使用してキャプチャされます。 vRNA チャネルの合計強度が 2,500 を超えるオブジェクトは感染していると見なされます。

薬理学的化合物とペプチドが、感染細胞の排出を減少させる能力についてテストされました。すべての実験において、最初のウイルス接種および洗浄ステップの後にオルガノイドを化合物に曝露しました。 Z-VAD-FMK (汎カスパーゼ阻害剤、R&D Systems、21631) およびパラニトロブレビスタチン (ミオシン II 阻害剤、Cayman Chemical、24171) を無水 DMSO に可溶化し、最終濃度 100 μM および 50 μM で感染オルガノイドに添加しました。それぞれμM。 GsMTx4 (機械感受性イオンチャネル阻害剤、Tocris、4912/100U) を分化培地に可溶化し、最終濃度 20 μM で感染オルガノイドに添加しました。 DMSO に可溶化された化合物が含まれる実験では、ウェル内の最終 DMSO 濃度はすべての条件にわたって 0.5% (v/v) で標準化されました。

感染の8時間後に、示差沈降による感染オルガノイド懸濁液の分画を実施した。分別中、すべてのサンプルは 4 °C に保たれました。オルガノイド懸濁液全体のサンプル (ウェル全体のサンプル) を、沈降ステップの前に収集しました。次に、オルガノイドを重力 (1g) によって 10 ～ 15 分間ペレット化しました。サンプルを共焦点顕微鏡で検査して、オルガノイドのペレット化を確認した。無傷のオルガノイドを含むペレットをDMEMで3回洗浄し、最終的に将来の分析のためにDMEMに再懸濁しました（オルガノイドサンプル）。収集されたオルガノイドの検査では、単一細胞による限定的な汚染が示されました (拡張データ図 5 および補足表 4)。元の培地中に押し出された細胞を含む上清 (細胞 + 培地サンプル) をさらに 600g で 3 分間遠心して、細胞および培地サンプルを生成しました。細胞ペレットを同様に DMEM で 3 回洗浄し、将来の分析のために DMEM に再懸濁しました (細胞サンプル)。これらの調製物ではオルガノイドは観察されませんでした。 600g のスピンからの上清も収集しました (培地サンプル)。洗浄ステップが細胞分画から遊離ウイルス汚染を除去するのに十分であることを確認するための外因性ウイルスのスパイクインを用いた実験では、106 PFU の EV-A71 ウイルスストックを細胞 + 培地サンプルに添加し、洗浄ステップを上記のように進めました。プラークアッセイによるウイルス力価の測定前に、すべての画分を凍結と解凍の 3 サイクルに供して、細胞またはオルガノイドを含む画分に細胞内ウイルスを放出させました。

感染したオルガノイドから押し出された細胞を、上記の分画実験と同様に収集した。重力ペレット化してオルガノイドを除去した後、押し出された細胞を 70 µm のナイロンメッシュセルストレーナーに通しました。小さなオルガノイドが 70 µm ストレーナーを通って流れているのが観察された場合、これらはさらに 10 g で 3 分間遠心分離することによって除去されました。押し出された細胞の 3 回目 (最終) の洗浄では、冷分化培地を使用して細胞を洗浄しました。この洗浄の上清を保持し、無細胞ウイルスの不完全な除去の結果である可能性のあるウイルスレベルを監視するための並行感染の接種材料として使用した。押し出された細胞を含むペレットを冷分化培地に再懸濁し、新しい細胞またはオルガノイドへの接種材料として直ちに使用しました。二次感染したRD細胞を感染の1～2日前に24ウェルプレートに播種し、感染直前にCa+2およびMg+2を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS++）で1回洗浄し、37℃で1時間接種した。 150 μl で上清または押し出された細胞を洗浄し、DPBS++ で再度洗浄した後、ウェルあたり 1 ml の RD 細胞培地を添加します。細胞培地を収集し、感染直後（1 時間）または感染 16 時間後に -20 °C で凍結しました。オルガノイドの二次感染は、オルガノイドの EV-A71 感染について上記した方法を使用して実行されました。しかし、押し出された細胞を接種材料として直ちに使用すると、二次感染に使用する前に接種材料のウイルス力価を定量することが不可能になったため、二次感染細胞は感染前の MOI の決定にカウントされませんでした。

統計データ分析はGraphPad Prism 9で実施しました。特に明記しない限り、ドナー固有の違いを考慮して、すべての実験は複数の異なるオルガノイドドナー株を使用して独立して3回実施しました。 1 つの代表的な実験のデータが示されている実験では、追加のドナーラインからのオルガノイドを使用して実験結果が再現されました。示されているすべての顕微鏡画像は、少なくとも 10 個のオルガノイドが調査され、同様の結果が得られた実験の代表的なものです。本文の定量的顕微鏡データ（図2d、e、3f、4f）については、それぞれ少なくとも10個のオルガノイドを調査する3つの独立した実験が実行されました。独立した実験からの平均値が統計的検定に使用されました。顕微鏡グラフでは、円は個々のオルガノイドの測定値 (技術的複製) を表し、三角形は同じ実験からのすべてのオルガノイドからのデータを蓄積することによって得られた測定値 (生物学的複製) を表します。シンボルの色は独立した実験を分類します。ここで使用されるこの「SuperPlot」グラフ形式は、Lord et al.59 によって詳細に説明されています。すべてのグラフにおいて、データは平均値 ± 標準偏差 (sd) として表示されます。各分析における特定の統計検定に関する情報は、図の凡例に記載されています。使用されたガウス統計検定では、データ分布は正規であると想定されていましたが、これは正式にはテストされていませんでした。統計検定の正確な P 値は、ソースデータファイルで見つけることができます。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物9、10、13で報告されたものと同様です。

それぞれの独立した実験内で、サンプル (オルガノイド) が実験グループにランダムに割り当てられました。オペレーターエラーの可能性を減らすために、提示された実験条件の構成 (プレートのレイアウトなど) はランダム化されませんでした。ウイルス力価データの収集（プラークの計数）は、無作為化および研究者によるサンプルの盲検化により実施された。顕微鏡データの収集には時間がかかるため、ランダム化と盲検化は適用されませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究では、寄託が義務付けられたデータセットは生成されませんでした。すべての生のグラフィックデータと関連する統計テストは、ソースデータファイルとして利用可能です。ソースデータはこのペーパーに付属しています。生の顕微鏡画像ファイルなど、この研究の結果を裏付けるその他のデータは、要求に応じて責任著者から入手できます。

コードは適用されません。

Taylor, MP、Burgon, TB、Kirkegaard, K. & Jackson, WT ポリオウイルスの細胞外放出における微小管の役割。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 83、6599–6609 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bird、SW、Maynard、ND、Covert、MW、Kirkegaard、K。オートファジー成分によって強化された非溶解性ウイルスの拡散。手順国立アカデミー。科学。 USA 111、13081–13086 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スー、ニューヨーク州他。ウイルスによる分泌経路の再構成により、RNA 複製のための異なる細胞小器官が生成されます。セル 141、799–811 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng、Z.ら。病原性ピコルナウイルスは、細胞膜をハイジャックすることによってエンベロープを獲得します。ネイチャー 496、367–371 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サンティアナ、M.ら。小胞に覆われたウイルスクラスターは、生物間のウイルス伝播に最適な単位です。 Cell Host Microbe 24、208–220.e8 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lanik, W.、Mara, M.、Mihi, B.、Coyne, C. & Good, M. 胃腸管におけるウイルス感染の幹細胞由来モデル。ウイルス 10、124 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

García-Rodríguez, I.、Sridhar, A.、Pajkrt, D. & Wolthers, KC 勇気を出して、ウイルス感染を研究するための腸オルガノイドモデル。ウイルス 12、1288 (2020)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

佐藤達也ほかヒト結腸、腺腫、腺癌、およびバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期増殖。消化器病学 141、1762–1772 (2011)。

ドラモンド、CG 他エンテロウイルスはヒトのエンテロイドに感染し、細胞系統特異的な方法で抗ウイルスシグナル伝達を誘導します。手順国立アカデミー。科学。 USA 114、1672–1677 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Good, C.、Wells, AI & Coyne, CB III 型インターフェロンシグナル伝達は、杯細胞のエンテロウイルス 71 感染を制限します。科学。上級 5、eaau4255 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao、X.ら。ヒト腸オルガノイドは、エンテロウイルスとコロナウイルスの腸内感染を再現します。 Stem Cell Rep. 16、1–12 (2021)。

Co、JY、Margalef-Català、M.、Monack、DM、Amieva、MR 上皮生物学と感染症を研究するためにヒト消化管オルガノイドの極性を制御します。ナット。プロトック。 16、5171–5192 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Co、JYら。上皮極性の制御: 宿主と病原体の相互作用のためのヒトエンテロイドモデル。 Cell Rep. 26、2509–2520 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heybrock, S. et al. リソソーム内在性膜タンパク質 2 (LIMP-2/SCARB2) は、リソソームコレステロールの輸送に関与しています。ナット。共通。 10、3521 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

山吉伸ほかスカベンジャー受容体 B2 は、エンテロウイルス 71 の細胞受容体です。医学。 15、798–801 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Leblond、CP & Walker、BE 細胞集団の更新。生理。改訂 36、255–276 (1956)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Darwich, AS、Aslam, U.、Ashcroft, DM & Rostami-Hodjegan, A. 前臨床動物種およびヒトにおける腸上皮の代謝回転のメタ分析。薬物メタブ。処分します。 42、2016–2022 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

ドウィヴェディ、VK 他複製ストレスにより、押し出しによる細胞の除去が促進されます。 Nature 593、591–596 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bras-Pereira、C. & Moreno、E. 機械的細胞競合。カー。意見。セルバイオル。 51、15–21 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Rosenblatt, J.、Raff, MC & Cramer, LP アポトーシスに向かう上皮細胞は、アクチンおよびミオシン依存性の機構によって、隣接する細胞に細胞を押し出すよう信号を送ります。カー。バイオル。 11、1847–1857 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Madara, JL 腸上皮の細胞押し出し部位における高分子バリアの維持: 密着結合の生理学的再配置。 J.メンバーバイオル。 116、177–184 (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Guan, Y. et al. マウス腸上皮細胞の生理学的脱落時の密着結合タンパク質 ZO-1 の再分布。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．細胞生理学。 300、C1404–C1414 (2011)。

Andrade, D. & Rosenblatt, J. 上皮細胞の押し出しのアポトーシス制御。アポトーシス 16、491–501 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boersma, S. et al. 単一 RNA ウイルスの翻訳と複製のダイナミクス。セル 183、1–16 (2020)。

記事 Google Scholar

Chang, Y.-L.、Ho, B.-C.、Sher, S.、Yu, S.-L. & ヤン、P.-C. miR-146a および miR-370 は、SOS1 および GADD45β を標的とすることにより、エンテロウイルス 71 誘導性の細胞アポトーシスを調整します。細胞。微生物。 17、802–818 (2015)。

Chi、C.ら。ヒト腸上皮細胞におけるエンテロウイルス 71 感染に対する強力な抗ウイルス応答。ウイルス研究所 176、53–60 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、M.-L. 他。 EV71 3C プロテアーゼは、hnRNP A1 の切断によってアポトーシスを誘導し、apaf-1 の翻訳を促進します。 PLoS ONE 14、e0221048 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リャン、C.-C. 他。エンテロウイルス 71 感染によって誘導されるヒト内皮細胞の活性化とアポトーシス。 J.Med. ヴィロル。 74、597–603 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アイゼンホッファー、GT 他密集は生細胞の押し出しを誘導し、上皮の細胞数を恒常的に維持します。ネイチャー 484、546–549 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gudipaty, SA & Rosenblatt, J. 上皮細胞の押し出し: 経路と病理。セミン。セル開発バイオル。 67、132–140 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ノドラー、LA et al. 細菌誘発性の粘膜上皮の押し出しを介した侵襲性サルモネラ菌の伝播。手順国立アカデミー。科学。 USA 107、17733–17738 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スーチーナ、TM et al. カチオン選択的伸長活性化チャネルを遮断する、グラモストラ・スパチュラータ・クモ毒由来のペプチド毒素の同定。 J. Gen. Physiol. 115、583–598 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bae, C.、Sachs, F. & Gottlieb, PA 機械感受性イオンチャネル Piezo1 は、ペプチド GsMTx4 によって阻害されます。生化学 50、6295–6300 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヴァルクティ、BH 他可溶性が高く、非光毒性、非蛍光性のブレビスタチン誘導体。科学。議員第 6 号、26141 (2016)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

カイパーズ、D. et al. 上皮修復は 2 段階のプロセスであり、最初は死にかけている細胞によって、次にその隣接細胞によって推進されます。 J. Cell Sci. 127、1229–1241 (2014)。

CAS PubMed Google Scholar

Bastounis, EE et al. 自然免疫シグナル伝達によって引き起こされる機械的競合により、細菌に感染した上皮細胞の集団的押し出しが促進されます。開発者セル 56、443–460.e11 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン、Y.-F. 他。マウスに適応したエンテロウイルス 71 株は、経口感染後にマウスに神経疾患を引き起こします。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 78、7916–7924 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、S.-C. 他。 SUMO化によって促進されるエンテロウイルス 71 3C の分解は、ウイルス複製および細胞アポトーシスの減少と相関します。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 286、31373–31384 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パーカー、A.ら。アポトーシスの上昇は、TNF による腸炎症において上皮細胞の代謝回転を損ない、絨毛を短縮します。細胞死障害 10、108 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

グディパティ、SA et al. 機械的ストレッチは、Piezo1 を介して急速な上皮細胞分裂を引き起こします。ネイチャー 543、118–121 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge、J.ら。哺乳類の機械感受性 Piezo1 チャネルの構造。ネイチャー 527、64–69 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schlegel, A. & Kirkegaard, K.、『ヒトエンテロウイルス感染症』(Rotbart、HA 編) 135–154 (ASM Press、2014)。

Armer, H. et al. 口蹄疫ウイルスは、ウシエンテロウイルスではなく、非構造タンパク質 3Cpro を介して宿主細胞の細胞骨格を標的とします。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 82、10556–10566 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バドルフ、C.ら。エンテロウイルスのプロテアーゼ 2A はジストロフィンを切断します。後天性心筋症における細胞骨格の破壊の証拠です。ナット。医学。 5、320–326 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cudmore, S.、Reckmann, I.、および Way, M. アクチン細胞骨格のウイルス操作。トレンド微生物。 5、142–148 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コックス、CDら。細胞骨格の機械保護的影響を取り除くと、PIEZO1 が二重層の張力によってゲート制御されることが明らかになりました。ナット。共通。 7、10366 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、J.ら。カドヘリン-β-カテニン機械伝達複合体を介したメカノゲーティングのために、ピエゾチャネルをアクチン細胞骨格につなぎます。 Cell Rep. 38、110342 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、Y.-H. 他。ホスファチジルセリン小胞は、エンテロウイルスの効率的な集団感染を可能にします。セル 160、619–630 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヤン、JEら。非エンベロープウイルスに感染した細胞からの感染性細胞外小胞の複雑さと超微細構造。科学。議員番号 10、7939 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エリクソン、AK 他。細菌は哺乳類細胞の腸内ウイルス同時感染を促進し、遺伝子組換えを促進します。 Cell Host Microbe 23、77–88.e5 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブラウン、JJ 他レオウイルスによって引き起こされる腸内のアポトーシスは、腸内感染の確立を制限します。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 92、e02062–17 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, S. et al. Nlrp9b インフラマソームは、腸上皮細胞におけるロタウイルス感染を制限します。ネイチャー 546、667–670 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickles、RJ & DeVincenzo、JP 呼吸器合胞体ウイルス (RSV) と細気管支炎を引き起こすその傾向。Ｊ．パソール。 235、266–276 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Eckardt-Michel、J. et al. RS ウイルスの融合タンパク質は、p53 依存性のアポトーシスを引き起こします。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 82、3236–3249 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヒッピー、CE 他麻疹ウイルスは、取り除かれた代謝活性な感染中心内のヒト気道上皮から出ます。 PLoS 病巣。 17、e1009458 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, W.-HW、Tsay, AJ、Lalime, EN、Pekosz, A. & Griffin, DE 一次分化した気道上皮細胞は、多核巨細胞を脱落させることによって心尖部の麻疹ウイルス感染に応答します。手順国立アカデミー。科学。 USA 118、e2013264118 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミヨシ、H. & スタッペンベック、TS スフェロイド培養における消化管幹細胞のインビトロ増殖と遺伝子改変。ナット。プロトック。 8、2471–2482 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang、S.-W.、Wang、Y.-F.、Yu、C.-K.、Su、I.-J. & ワン、J.-R. VP2 および VP1 キャプシドタンパク質の変異は、ウイルス結合と RNA 蓄積の増強により、エンテロウイルス 71 の感染力とマウス致死性を高めます。ウイルス学 422、132–143 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lord、SJ、Velle、KB、Mullins、RD & Fritz-Laylin、LK SuperPlots: 細胞生物学における再現性と変動性を伝える。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 219、e202001064 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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J. Co、M. Margalef-Català、K.-F に感謝します。 Weng は専門知識と試薬の共有に、C. Kuo (スタンフォード大学) はオルガノイド細胞株の寛大な提供に、J. Theriot、M. Ott および B. Burkholder は科学的議論に、P. Sarnow と J. Carette は本論文の批判的な読解に協力してくれました。原稿。イラストは Biorender.com で作成されました。この研究は、Chan-Zuckerberg BioHub (KK)、スタンフォード大学 BioX (ARC)、ノボノルディスク財団助成金 NNF19OC0056411 (MRA)、および国立衛生研究所助成金 R01AI13491204 (KK)、5U19AI116484-06 (MRA)、T32GM007276 ( JM) および T32AI1007328 (JM)。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定や原稿の準備には何の役割もありませんでした。

この作品は、Manuel R. Amieva、Karla Kirkegaard の著者が共同で監修しました。

スタンフォード大学微生物学および免疫学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ジャスミン・モシリ、マヌエル・R・アミエバ、カーラ・キルケゴール

スタンフォード大学遺伝学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

アルサ・R・クレイブン、サラ・B・ミクソン、カーラ・キルケゴール

スタンフォード大学小児科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

マヌエル・R・アミエバ

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JM は実験を考案、設計、実行し、データを分析し、元の原稿を起草しました。 KK は、提案された研究の構想と実験の設計に参加しました。 ARC は図 1 と 2 の実験に貢献しました。 1b および 5b–i を参照し、拡張データ図で実験を実行しました。 SM は図 4 と拡張データ図 3 の顕微鏡検査を実施しました。KK と MRA は共同で研究を監督し、結果の解釈に参加しました。 KK、MRA、JMが資金調達を獲得。 JM、KK、MRAが原稿を編集・改訂しました。

カーラ・キルケゴールへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Nihal Altan-Bonnet 氏、Stanley Perlman 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ポリオウイルス 1 型 (Mahoney) に感染した細胞がオルガノイドから押し出される様子が免疫蛍光によって観察されました。 (ab) MOI = 1 PFU/細胞で 42 時間感染させた結腸オルガノイド。 MOIは、HeLa細胞上のウイルス力価によって決定されました。スケールバーは 10 μm に相当します。

基底側外側オルガノイド極性を有する分化したコロノイドをEV-A71に感染させ、感染後8時間で免疫蛍光により視覚化した。 (a) 感染コロノイドの内腔では、頂端微絨毛刷子縁の強い F-アクチン染色が観察されました。ウイルス感染細胞は、上皮層内と頂端内腔内の両方で観察できます。（ b 、 c ）EV-A71感染細胞は、側底外側コロノイドの内腔に頂端側に押し出されました。スケールバーは 10 μm に相当します。

(a) 感染したオルガノイドを感染の最初のサイクルの各時点で固定し、蛍光顕微鏡を使用して感染細胞と非感染細胞の数を数えました。各ドットは、個々のオルガノイド内の感染細胞の割合を表します。三角形は、各時点のすべてのオルガノイドの平均値を表します。タイムポイントごとに定量化された N = 10 個のオルガノイドを使用した 1 つの実験。オルガノイド内の感染細胞の割合のピークは 7 hpi で現れ、9 hpi 後に減少しました。このグラフに示されている生の細胞数は補足表 2 に表示されます。(b – d) 各時点の代表的な感染細胞。押し出された感染細胞には、視覚化された時点に関係なく、同様に豊富な vRNA シグナルが含まれています。スケールバーは 10 μm に相当します。

ソースデータ

蛍光発生カスパーゼ 3/7 基質 CellEvent の存在下で感染したコロノイドから完全に押し出された細胞を 48 hpi で収集し、固定し、倍率 20 倍の蛍光顕微鏡で検査しました。 (a) 画像化された細胞の 3D レンダリングは、Volocity 画像解析ソフトウェアを使用して視覚化されました。感染したセルは黄色のボックスで囲まれます。 (b) Volocity の計算測定ツールを使用して、A と同様に 20 の固有の視野から個々の細胞を識別しました。データは N = 743 個の個々の細胞から収集されました。 vRNA チャネル内のピクセル強度が立方ミクロンあたり 1.5 を超える細胞は感染していると特定されました。 N = 39 感染細胞、全体の 5.2%。 (c) B で定義した細胞のカスパーゼ 3/7 活性を比較しました。感染細胞のカスパーゼ活性は、非感染細胞のカスパーゼ活性と同等でした。対応のない両側 t 検定。データは平均±SDとして表されます。 N = 39 感染細胞; N = 704 個の未感染細胞。

ソースデータ

オルガノイド培養物の分別後、すべての分画を組織培養顕微鏡で視覚的に検査し、標的集団の収集を評価しました。 (a) 倍率 40 倍でのオルガノイド画分の視覚検査により、オルガノイドが重力ペレット (1 xg) で収集されたことが確認されます。 (b) A で強調表示された領域。単一細胞もオルガノイド画分中に少量存在しました (矢印は例を示します)。これは、分画中にオルガノイドから継続的に細胞が押し出された結果である可能性があります (矢印)。

我々は、感染細胞の押し出しを促進する可能性のある、感染細胞における機械感受性イオンチャネルの活性化の潜在的な手段について 2 つの仮説を提供します。 Piezo1 などの機械感受性イオンチャネルは、(a) 膜変形を誘発する外部圧縮力、および (b) つながれた細胞骨格フィラメントを介して伝達される細胞固有の機械力によって活性化されます。 (c、d) ウイルス感染がアウトサイドインまたは細胞固有の力の両方を介してチャネル活性化をどのように誘導するかについての概念モデルを提示します。 (c) 未感染細胞では、細胞骨格フィラメントが原形質膜の下に構造的支持を提供し、細胞外力による膜の変形を軽減します。アクチンが再構成されている感染細胞では、この構造的サポートが失われている可能性があり、その結果、「より柔らかい」膜が外部の圧縮力によってより容易に変形することになります。 (d) フィラメントを通る力モデルでは、細胞固有の機械力が細胞骨格フィラメントへのテザリングを介してピエゾチャネルに伝達されます。感染した細胞では、細胞骨格の再構成により、つながれたピエゾチャネルに力が直接伝達され、活性化が誘導される可能性があります。 BioRender.com による「PIEZO Channels: How Do They Allow Mechanosensation?」 (2022) から引用。 https://app.biorender.com/biorender-templates から取得。

ヒト (a) 胃組織および (b) 十二指腸組織由来の頂端から出た分化した上皮オルガノイドをエンテロウイルス A-71 に感染させました。ウイルス力価をプラークアッセイによって経時的にモニタリングした。 1 人の固有のドナーとパネルごとの実験からのデータが技術的に 3 つずつ表示されます。表されたデータは平均値±SDです。

ソースデータ

補足表 1 ～ 4。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Moshiri、J.、Craven、AR、Mixon、SB 他。結腸オルガノイドからのエンテロウイルス A71 感染細胞の機械感受性押し出し。 Nat Microbiol 8、629–639 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

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受領日: 2022 年 7 月 31 日

受理日: 2023 年 2 月 10 日

公開日: 2023 年 3 月 13 日

発行日：2023年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

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エンテロウイルス A71 の機械感受性押し出し