ミネラルおよび有機栽培培地は、無土壌培養システムにおいて独特の群集構造、安定性、機能性を備えています。

Scientific Reports volume 6、記事番号: 18837 (2016) この記事を引用

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植物の栄養、成長、サポートのための無土壌栽培培地の選択は、園芸システムにおける生産の環境持続可能性を向上させるために非常に重要です。 この生態系に生息する機能的な微生物群集についての現在の理解はまだ限られているため、私たちは、開放的な無土壌園芸システムで使用される 2 つの最も重要な栽培培地 (有機および無機) の微生物群集の発達を調べました。 私たちは、時間の経過とともにコミュニティの構成に影響を与える要因を特定し、成長するメディア全体での個々の分類群の分布とその潜在的な機能を比較することを目的としました。 ハイスループットシーケンス分析により、有機栽培培地における独特で安定した微生物群集が明らかになりました。 常在細菌群集に関連する主な要因として、湿度、pH、硝酸態窒素、アンモニウム態窒素、および導電率が明らかになりました。 アンモニウム-N は根粒菌科の存在量と相関しており、メチロフィラ科と放線菌科の両方と根粒菌科との潜在的な競合相互作用が示唆されました。 私たちの結果は、土壌のない増殖培地が、一時的な機能安定性を備えた多様な細菌群集にとって独特のニッチであり、それが外力に対する耐性に影響を与える可能性があることを明らかにしました。 地域社会におけるこうした違いを利用して、生産性と品質を向上させた持続可能な園芸を目指す戦略を立てることができます。

米国、カナダ、ヨーロッパでは、温室野菜、特にトマトの 95% が、園芸用培地を使用した無土壌温室植物栽培システムで生産されています1。 開放的な無土壌園芸システムには、植物の健全な成長に必要な栄養素、酸素、水が制御され 2、土壌伝染病原体を回避できるという点で、従来のシステムに比べて利点があります。 西ヨーロッパでは、ほぼすべての温室栽培トマトが、無機合成繊維からなるミネラル栽培用培地で生産されています5。 鉱物成長培地は、輝緑岩、石灰岩、コークスから製造され、これらは 1500 °C で溶かされて繊維に紡がれます6。 対照的に、泥炭とココナッツは、EU7 諸国で生産される栽培培地の有機由来の成分として最も利用されています。 鉱物栽培用培地は中性 pH、高い空気含有量、低密度を持っていますが、有機栽培用培地は有機物含有量が高く、栽培用培地を灌漑する水溶液との陽イオン交換能力が特徴です。 これらの違いにもかかわらず、トマト果実 (Solanum lycopersicum) の収量と数は、連続数年間にわたって無機培地または有機栽培培地で栽培された植物間で同等でした 8。

無土壌温室システムの持続可能性は、収量の増加と栽培プロセスの一般的な効率に大きく依存しています4。 最終的な収量と品質を保証するために、温室では消毒措置が講じられています4。 しかし、これは有害な微生物だけでなく、植物にとって潜在的に有益な微生物分類群も排除することになります。 これにより、最終的に群落が平衡と安定に達することが妨げられ、これらの無土壌栽培システムは病原体侵入の危険にさらされる可能性があります4。 生物多様性は、複数の種の共存による機能の冗長性の結果として、生態系の機能低下から生態系を保護します9,10。 これは、細菌の呼吸、微生物のバイオマス生産、および植物の栄養素の貯蔵にプラスの影響を与えるため、生産性の向上にもつながる可能性があります11。 さらに、栄養の摂動や外来種などの外力に対する一時的な機能安定性と耐性の増加が報告されています10,12。

「植物の第 2 ゲノム」とも呼ばれる複雑な植物関連微生物群集は、植物の健康、成長、発育にとって重要です 13。 培地の増殖に関連する微生物群集を調査するこれまでの研究は、主に病原性細菌や真菌が存在しないことに焦点を当ててきました 14。 時間の経過に伴う群集の構成、成長するメディア全体にわたる個々の分類群の分布、およびそれらの潜在的な機能に影響を与える要因についての理解は限られています。 生産性の向上を目的とした効果的な管理戦略が欠如しているため15、根圏、生育培地、およびその微生物集団を注意深く監視する必要性が高まっています。

この研究では、開放的無土壌園芸システムで使用される 2 つの最も重要な栽培培地、有機培地 (GB) と鉱物培地 (RW) の微生物群集の発達を調べました。 私たちは、RW と GB の成長培地が、潜在的に独自の機能を備えた異なるコミュニティ構造を発達させるという仮説を立てました。 根圏内の変動の多くは、植物の根と生育培地の条件によって決まります。 したがって、根圏と生育培地に関連する微生物群集は強く結びついています。 これらの違いに関する知識は、生産性と品質が向上し、外力に対する耐性が高まる可能性のある持続可能な園芸に向けた戦略を開発するために使用できます12。 Agrobacterium rhizogenes 感染によって引き起こされる毛状根症候群は、トマト植物の総収量が最大 10% 減少する可能性があるため、温室園芸における主要な問題です 16。 私たちの研究では、RW 培地 (RWS) で生育するいくつかの植物で自然に発生する A. rhizogenes 感染が検出されました。 根、根圏、成長培地の間で起こる相互作用、および我々の研究で代表される A. rhizogenes による外力に対する潜在的な抵抗力も評価されました。

キチノファガ科、キサントモナス科、フラボバクテリア科、ハイポミクロビア科、ミクロバクテリア科、コマモナダ科、腸内細菌科、メチロフィラ科、根粒菌科、シュードモナス科、およびスフィンゴバクテリア科は、両方の増殖培地で相対的に最も豊富な細菌科でした (図 1A)。 GBではキチノファガ科、メチロフィラ科、ハイポミクロビア科が豊富であったが、RWではミクロバクテリア科が増加した。 腸内細菌科、Verrucomicrobiaceae、および根粒菌科は、RWS では豊富であり、GB では減少しました (表 1 および 2)。 順列多変量分散分析 (PERMANOVA) により、細菌ファミリーの相対存在量の違いに、時点ではなく増殖培地タイプが有意に寄与していることが確認されました (P < 0.05、図 1B)。 DGGE プロファイルの分析により、RWS サンプルは時間に関係なくグループ化される一方、残りのサンプルは時点に従ってクラスター化する傾向があることが示されました (補足図 1)。 種の総数はGBの方が多かった（P < 0.05）が、GBとRWの間の多様性と均一性は時点全体で大きく異なりました（P < 0.05、補足表1）。 RW と RWS は、多様性と均一性の指標において一貫した類似性を示しました (補足表 2)。

(A) 園芸栽培培地中に存在する細菌科の相対的な存在量。 配列数が最も多いファミリーと、それに対応する RDP 分類が表示されます。 RW: ミネラル成長培地。 GB: 有機栽培用培地、RWS: 毛深い根を持つミネラル培地。 データセットは最低の配列数まで希薄化されました。 相対存在量は、同じファミリーに属する OTU の数を合計して計算されました。 (B) コミュニティ構造は、成長するメディアの種類によって大きく異なりました。 グループ分散 (分散) の多変量均一性の分析が実行され、非計量多次元スケーリング分析を使用して細菌群集間の類似性が評価されました。 記号は培地の種類を示します。丸、有機栽培培地 (GB)。 三角形、鉱物成長培地 (RW)。 正方形、毛深い根を持つミネラル成長培地 (RWS)。 凡例内の数字は時点を示し、文字はサンプルの複製を示します。 たとえば、「GB1A」は、最初の時点で収集された有機栽培培地の複製「A」を指します。

多因子分析（MFA）により、GB に関連する家族は次元 1 で表され（P < 0.0001、図 2A）、全サンプル間の相対存在量の分散の 28% を占めることが示されました。 ジェマティモナダ科、シノバクテリウム科、ソランギ科、オピツテ科、デスルホバクテリウム科、アクチノバクテリ科、ハヘルラ科、ガイエラ科、ハイポミクロビア科、メチロフィラ科、酢酸菌科、メチロシスタ科、コネクバクテリア科、キサントバクテリア科および未分類のニトロスピラはGBと有意に関連していた。 RWと相関する細菌ファミリーは薄暗く表示されました。 3 (P < 0.05) であり、総分散の 11% を説明しました。 シュードノカルジネ科、プロピオニバクテリネ科、バクテロイダ科、コモモナダ科、インサータエ 根粒菌目、およびクリオモルファ科がこの次元に関連していた。 根粒菌科、Verrucomicrobiaceae、Planctomycetaceae、Simkaniaceae、Piscirickettsiaaceae、および Caldilineaceae は RWS に関連する科であり、Dim に含まれていました。 5 (P < 0.05、補足表 3)。

(A) 園芸栽培培地中の細菌科の存在量の変動。 相関円によれば、多因子分析の最初の要素 (ディメンション 1) に属する科は、根粒菌科に属する種の存在量と負の相関があります (23)。 Dim 3. にはより多くのファミリーが存在するため、サンプル間の全体的な分散に対するそれらの寄与は小さくなります。 次元 3 は、RW と有意に相関した家族を示しました (P < 0.05)。 1、プロピオニバクテリネ科。 2、シュードノカルディネ科。 3、ロドバクテリウム科。 4、カイディバクター。 5、根茎菌目。 6、未分類のニトロスピラ。 7、メチロフィラ科。 8、ガイエラ科。 9、酢酸菌科。 10、放線菌科。 11、キサントバクテリア科。 12、ハヘル科。 13、シノバクテリウム科。 14、Desulfobacteraceae。 15、ハイフォ微生物科。 16、オピタ科。 17、ジェマティモナダ科。 18、メチロシスタ科。 19、ソランギ科。 20、ヒョウホモナス科。 21、クロマティ科。 22、ロドサイク科。 23、根粒菌科。 (B) 多因子分析マップは、有機栽培培地 (GB) からのサンプルが各時点にわたって同様の存在量を示し、ミネラル培地 (RW) のサンプルとは異なることを示しました。 毛状根を持つ RW (RWS) のサンプル中の細菌科の存在量は、RW のものと同様でした。 記号は増殖培地タイプを示します。黒丸は GB、灰色の三角は RW、白四角は RWS を表します。 凡例内の数字は時点を示し、文字はサンプルの複製を示します。 たとえば、「1A」とラベル付けされた円は、最初の時点で収集された GB の複製「A」を指します。

グループ平均分散のペアワイズ比較に関するテューキー検定は、R のビーガン パッケージを使用して実行されました。多様性と均一性の尺度 (補足表 1 および 2) で示されているように、時間と増殖培地の種類の間の相互作用は 3 番目の時点で有意でした ( P < 0.05)。 細菌ファミリーの相対的な存在量と、アルファ多様性と均一性の尺度に基づいて、各増殖培地に関連する独特で安定した微生物群集の存在を検証しました（表 1、2、および図 2B）。

植物の収量は、有機栽培培地と鉱物栽培培地の両方について生育期の終わりに測定され、合計累積収量（生重）はそれぞれ59.27 ± 1.52 kg.m-2 と61.59 ± 0.86 kg.m-2 となりました。 カルシウム、マグネシウム、硫酸塩、硝酸態窒素、ナトリウムおよび導電率は、GB の方が RW よりも高く、カルシウム、マグネシウム、硫酸塩、硝酸態窒素、ナトリウムおよび導電率は、GB の方が RW より高かった (P < 0.05)。 RWでは（P < 0.05）、アンモニウム-N、カリウム、鉄、マンガンはGBと比較してRWで有意に高かった（P < 0.05、補足表4）。 アンモニウム-N、pH、導電率、カリウム、ナトリウム、鉄、塩化物はRWSで最も高かった（P < 0.05、補足表5）。 導電率と硝酸態窒素の間の正の相関は GB で一貫して検出されましたが、アンモニア態窒素は 3 番目の時点でのみ総 CFU と関連していました (P < 0.05、表 3)。 RW では、pH はアグロバクテリウム属と正の相関がありました。 CFU、導電率、アンモニウム-N、硫酸塩、ナトリウムは総 CFU と負の相関がありました。 硫酸塩のみが、各時点にわたってナトリウムと正の相関を示した(P < 0.05、表 4)。 カルシウムとアグロバクテリウム属の間の正の相関。 および総 CFU は常に RWS で見つかりました (P < 0.05、表 5)。 対照的に、湿度はアグロバクテリウム属と負の相関がありました。 毛根が最初に検出されたときの総CFU (P < 0.05)。 MFA の目標は 2 つあります。1 つは測定された変数に基づいて生育培地を識別すること、もう 1 つは生育培地内の物理化学的および生物学的特性間の相関関係を解明することです。 一般に、MFA は、細菌全体、アグロバクテリウム属の細菌であることを示しました。 CFU、湿度、pH、硫酸塩、および導電率は、サンプル間の合計分散に最も大きく寄与する特性でした (図 3A)。 アンモニウム-N およびアグロバクテリウム sp. CFU は、次元 1 との相関が最も高い 2 つの変数であり (P < 0.0001、補足表 6)、分散の 29.8% を占めました。 二乗相関比は、変数と特定の軸の間の関連度を測定します。 したがって、サンプルの座標と増殖培地タイプの間の cos2 により、上記が Dim の RWS 培地を説明する主な特性であることが明らかになりました。 1 (cos2 > 0.5)。 薄暗い。 2 (総分散の 26.7%) は GB の特徴 (硫酸塩、導電率、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、硝酸態窒素) によって構成されていますが、カリウム、マンガン、鉄、湿度は Dim に含まれています。 RW では 3 (P < 0.05、分散の 13.6%)。 我々は、各増殖培地が物理化学的および生物学的変数の固有のセットによって特徴づけられ、それが時間の経過とともに保存されることを確認しました（図 3B）。

生育培地の物理的および化学的特性は環境ごとに異なります。

(A) 園芸栽培用培地の物理的および化学的特性の多因子分析。 相関円は、成長するメディア間の差異を引き起こす変数の寄与を示します。 同じ方向の長いベクトルは変数間の正の相関を示し、反対方向の長いベクトルは負の相関を示します。 (B) 多因子分析では、物理的および化学的特徴に基づいて、時間の経過とともに成長する培地サンプル間の類似性が強調されました。 記号は増殖培地タイプを示します。黒丸は GB、灰色の三角は RW、白四角は RWS を表します。 凡例内の数字は時点を示し、文字はサンプルの複製を示します。 たとえば、「1A」とラベル付けされた円は、最初の時点で収集された GB の複製「A」を指します。

変数の各ペア間のピアソン相関係数を計算する代わりに、正則化正準相関分析から得られたペアごとの類似性行列を使用して二部ネットワークが推論されました (図 4)。 類似性行列の値は、細菌ファミリーの相対存在量と、分析で保持された最初の成分が広がる空間に投影された増殖培地の特性との間の相関関係として計算されました。 閾値を 0.5 に設定して、3 つの関連成分が得られました。 このようにして、アンモニウム N は根粒菌科の存在量と相関関係がありました。 RWに関連する家族は鉄と相関し（P < 0.05）、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよび硝酸塩はGBと関連していました（P < 0.05）。 コレスポンデンス分析（CA、補足図2）を使用して、増殖培地（行）と物理化学的変数および相対存在量（列）の間の関連性を明らかにしました。 カイ二乗統計は、生育培地と物理化学的変数および相対存在量の両方との間に強い関連性を示しました (P < 0.05)。 行/列変数の座標は、行/列変数が重心から離れている標準偏差の数を表します17。 したがって、Dim.1 の最も高い座標は Agrobacterium sp に属していました。 CFU、Solimonadaceae、アンモニア-N および P (行)、RWS および時点 3 (列)。これらはすべて分散の 92.9% を説明します。 薄暗い。 2 は、時点 2 で GB で検出された最も豊富なファミリー間の関係によって決定されました。観察された相互作用は、以前の相関分析の結果を裏付けました (表 1 および 2)。

細菌ファミリーの存在量と増殖培地の物理化学的特性の間の正規化された標準相関関係に基づくネットワーク グラフ。

相関 (r) は 0.5 を超える絶対相関に対してフィルタリングされており、表示されているキーに従って色分けされています。 グラフ化アルゴリズムによると、より強い相関関係は短いラインであり、成長培地内で同様の存在量を持つファミリーは密集する傾向があります。 この表現は、環境のさまざまな物理的および化学的特性に関連付けられた家族のクラスター間の関係を明らかにし、したがって、成長している培地固有の集団を明らかにする可能性があります。 緑色は細菌ファミリーが RW と相関しています。 赤はRWSと関連する細菌ファミリー、紫はGBと相関するファミリー。

2 つの成長培地の保水曲線を決定しました。 RW の飽和体積水分含量 (θs = 0.9834) は、Wallach18 の以前の報告と一致しましたが、GB の飽和体積水分含量は θs = 0.935 でした。 RW の体積水分含量 (θv = 85.3%) は、マトリックス電位 -0.6 kPa に対応しますが、RWS の θv = 83.1% は、マトリックスポテンシャル -0.61 kPa に対応します。 有機栽培培地の場合、θv = 81.93% は、マトリックス電位 -0.46 kPa を表します。

7 つの RW サンプル (15 個中 46.7%) は A. rhizogenes biovar 2 に対して陽性でしたが、GB からのサンプルは試験したアグロバクテリウム sp. のいずれの種に対しても陰性でした。 (補足表 7)。 植物病原性アグロバクテリウム属株は、根誘導 (pRi) プラスミドの病原性領域 (virC) に T-DNA プロセスと転移に必要な遺伝子を保有しています 19,20。 したがって、A. rhizogenes biovar 2 陽性の RW サンプルとすべての RWS サンプルを virC 病原性遺伝子の存在についてスクリーニングし、すべての RWS が陽性と検査されました。 選択培地のプレート数により、マルチプレックス PCR の結果が確認されました。 ランダムに選択された野生型分離株におけるコロニー PCR の結果により、RWS における virC 遺伝子および A. リゾゲネス バイオバー 2 の存在が検証されました (補足表 7)。 アグロバクテリウムの違い。 sp. 増殖培地間のCFUは時間の影響を受け、RWSと比較した場合RWの方が低かった（P <0.05、補足表7）。

各栽培培地に関連するファミリーの相対的な存在量に基づいて、有機栽培培地における競合的で独特で安定した微生物群集構造の存在を検証しました。 さらに、我々は、湿度、カリウム含有量、pH、および導電率が、生育培地中の微生物群集を駆動する主な物理化学的特性であることを特定しました。

分子技術と組み合わせたハイスループットシーケンシングにより、増殖する培地に関連する微生物叢の構造が明らかになりました。 GB は RW および RWS よりも高い細菌多様性を保持していました。 さらに、GB は各時点にわたって同様の細菌ファミリーの存在量を示しましたが、RW と RWS は両方ともより大きなばらつきを示しました。 これらの違いは、2 種類の増殖培地の異なる構造と組成に関連している可能性があり、微生物群集に独特のニッチを提供する可能性があります 21。 微生物群集の密度と生物多様性は、培地の年齢によって影響を受ける可能性があります22。 鉱物栽培培地を使用した土壌のないシステムにおける生物多様性は作物の開始時には低く 4、その後数週間以内に増加し 23、植物の生長から 6 週間後には安定に達します 24。 以前のレポートで説明したように 21、我々の未培養 RW 培地は GB (2.2 × 107 CFU g-1) と比較して、栄養素と総細菌 CFU (<102 CFU g-1) の量が低かった。 根域、栄養溶液、生育培地、システム装置（チューブ、側溝など）など、システムのさまざまな部分に定着している培養可能な好気性微生物叢からの生細胞数（CFU）の定量化が行われています25。 しかし、R2A 寒天培地でのプレート培養に基づく技術からは微生物叢の 1 ～ 10% しか回収できず、各増殖培地に存在する群集全体についての限られた情報が得られます。 このため、私たちは培養研究を微生物群集の分子的特徴付けで補完しました。

生育培地で観察される微生物の生物多様性の増加は、植物の活動に起因すると考えられます。 植物は、光合成によって固定された炭素の最大 21% を根と土壌の界面に滲出させ 26、微生物群集に栄養を与え、微生物群集の活動と多様性に影響を与えます 14。 Berendsen ら 27 は、植物種が特定の根滲出液の生成を通じて細菌を選択し、それによって植物のマイクロバイオームを形成できることを示唆しました。 浸出能力が高いことで知られるトマト台木（Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites）に接ぎ木したナスを使用しました。 栽培されたナスは同等の成長特性と収量を示したため、両方の成長培地における根の浸出は同様であると推定されました。 私たちは、6 か月後でも、ミネラル成長培地 (RW と RWS の両方) 内の微生物群集が、時点間で高い変動性を示していることを発見しました。 Garbeva ら 28 は、安定したシステムでは、それぞれの微小生息地はニッチに定着できる生物によって占められていると仮説を立てました。 微小生息地レベルでの多様で安定した生態系は、環境ストレス 29 や潜在的には病原体の侵入に抵抗します。 Mendesらは、いくつかの細菌分類群の相対的な存在量が疾患抑制の指標である可能性を示唆した。 このように、病原体の侵入に対する耐性の増加は、資源をめぐって病原体と競合したり、直接的な拮抗作用によって阻害を引き起こしたりする、増殖培地中の総微生物バイオマスに関連している可能性があります15。 Mendesら14は、放線菌、γ-およびβ-プロテオバクテリア（シュードモナス科、バークホルデリア科、キサントモナダ科）およびファーミクテス属（乳酸桿菌科）を、自然土壌における病気の抑制に関連する最もダイナミックな分類群として特定した。 我々の研究では、ロドサイク科およびメチロフィラ科（β-プロテオバクテリア）がGBに加え、ハイフォミクロビア科、キサントバクテリア科、フィロバクテリア科、クロマティ科などの他のα-、β-およびγ-プロテオバクテリアと相関関係にありました。 Gaiellaceae や Conexibacteraceae などの放線菌も GB と正の相関がありました。 さらに、GB における根粒菌科 (アグロバクテリウム属など) の存在量は、メチロフィラ科およびサプロスピラ科の存在量と負の相関がありました。 したがって、いくつかの分類群の相対的な存在量と微生物群集の安定性は、外部侵入者に対する抵抗力に関連している可能性があり、全体的な抑制の理論を裏付けています。 アグロバクテリウム sp. 両方の増殖培地で検出されました（全時点で平均して GB で 7.6 × 103 CFU/ml、RW で 2.4 × 104、RWS で 1.0 × 106 CFU/ml）、GB からのサンプルは virC 病原性の存在について陰性でした。遺伝子。 総CFUも特定の微生物分類群の存在も、アグロバクテリウム・リゾゲネスに対する耐性と直接関係しているわけではない27。

植物、および生育培地における複雑な生物学的、化学的、物理的相互作用は、根圏の微生物群集に影響を与えます。 以前の報告では、土壌中の微生物群集の主な要因として pH が特定されています 30。 土壌水分は pH と関連していることが多く、GB、RW、RWS 間の群落構成に影響を与えている可能性があります。 さらに、GB では、土壌 pH30 と関連する放線菌科およびα-プロテオバクテリアの相対存在量がより高いことが示されました。 根粒菌の移動性は生育培地の湿度によって制限される可能性があり、水で満たされた細孔は細菌細胞と同じくらい大きい可能性があります 31。 アグロバクテリウム sp. 毛根は GB と RW で検出されましたが、GB では視覚的には存在しませんでした。 我々の結果は、GBとRWの間の細孔径と水分分布の違いがアグロバクテリウム属の移動性に影響を与え、その結果、病気の発生率が減少した可能性があることを示しています。 硝酸アンモニウム (NO3--N/NH4+) 比が土壌 115 mg NH4+-N/l および 553 mg NO3--N/l で 5 に近い場合、A. rhizogenes の侵入を示す毛状根の高収量が観察されました。土壌32． 私たちのテストでは、NO3--N/NH4+-N 比は RWS で 2.3、RW で 31.9、GB で 147.3 でした。 GB 培地の低いアンモニア濃度と低い pH は、毛状根が存在しないことを説明し 33 、潜在的に微生物群集の組成を形成している可能性があります。

私たちの方法論は、園芸培地における複雑な細菌の相互作用についての包括的な洞察を提供し、各タイプの園芸栽培培地に関連する細菌群集の間に根本的な違いがあるという私たちの仮説を裏付けました。 多様で競争的な微生物群集は、異なる独自の機能を提供する可能性があります。 結果として、GB 培地に生息する細菌群集は、この不均一で変動する環境に対して機能的多様性と一時的な安定性および回復力を提供した可能性があります。 最終的には、住民コミュニティ内の相互作用も、従来の無土壌栽培システムで競合する外来種などの外力に対する抵抗力に役割を果たしている可能性があります。 将来の代替防除戦略には、微生物グループの抑制性の評価と、0.1 ～ 10% の抑制性土壌を含む導電性土壌への抑制性の移行が含まれる可能性があります 15。 記載された関係は、生育培地に関連する機能的な微生物生態学および微生物群集と植物の間の相互作用の理解にも貢献します。 これらの関係に関する知識は、植物の生産性と品質を向上させるための持続可能な戦略を開発するために使用できる可能性があります。

オランダ（緯度 51 度 59 分、経度 4 度 10 分）の 8.5 ヘクタールの商用温室で、接ぎ木されたナス Solanum melongena 品種 Jaylo（オランダ、Rijk Zwaan）を栽培し、さまざまな生育培地に関連する微生物群集をモニタリングしました。 Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites Beaufort (De Ruiter、オランダ) について。 ２つの異なる園芸用生育培地を同時に温室内に設置し、同日に２つの異なる生育培地の上に生後４８日のナスを植えた。 有機栽培培地 (GB、Grow Bag、Peltracom、ベルギー) は、白泥炭 (フォン ポスト スケール 34 の H2 ～ H4 [80% v/v] とココナッツ ファイバー [20% v/v]) の混合物でした。 GB およびミネラル培地 (RW、ロックウール、Grotop Expert、Grodan、オランダ) のスラブの寸法は、それぞれ 1.0 m × 0.2 m × 0.085 m および 1.0 m × 0.2 m × 0.075 m でした。 両方の成長培地は、標準的な方法に従い、標準的な肥料溶液 21 を使用して、栽培期間中に同一の水および肥料処理を受けました。 ナスは１枚に２本ずつ植えました。 各植物は 3 つの茎に訓練され、植物密度 1.7 植物/m2、結果として 5.1 茎/m2 になることを目指しました。

温室は、ランダム化されたブロック設計でそれぞれ 6 列からなるいくつかのブロックに分割されました。 2 つの連続したブロックがランダムに選択され、各ブロックには RW または GB 媒体が含まれていました。 各ブロックの外側の 2 つの行は、隣接する行と相互作用する可能性があるため、選択されませんでした。 ナスは44cmの間隔で連続して置かれたスラブで成長していました。 1 つのスラブを実験ユニットとみなしました。 各ブロックから 5 つのスラブを内側の 4 つの列と 2 つの異なる成長培地 (GB および RW) からランダムに選択しました。 異なる実験ユニットのサンプルは、生育期 (6 月、7 月、8 月) と実験の開始時の 3 つの時点で収集されました。 各実験ユニットから 10 個のサブサンプルを収集、プールし、均質化し、単一サンプルとして処理しました (補足図 3)。 各時点で、根の材料を含むサンプルを各 RW および GB の 5 つの固定実験ユニットから採取しました。 200 g の各サンプルは、さらなる分析のために 50 g の 4 つの均質なサブサンプルに分割されました。2 つのサブサンプル (サブサンプル 1 および 2) は化学分析に使用され、1 つのサブサンプル (サブサンプル 3) は 4 °C で保存され、分離と同定に使用されました。アグロバクテリウム属の総CFU、および湿度の測定とサブサンプル4を直ちにドライアイス上に保管し、-80℃で保存し、分子微生物群集分析に使用しました。 この栽培者は、病原体アグロバクテリウム・リゾゲネスによって引き起こされる毛状根症候群の過去の存在を報告しました。 したがって、毛根症候群の発生率は、月に一度の温室の目視検査によって追跡調査されました。 毛深い根症候群は、6 月の最初の時点で 1 つの RW スラブで検出されました。 7月と8月にさらに目視検査を行ったところ、RW培地で毛状根症候群の発生率が増加していることが判明した。 毛状根症候群の視覚的症状を示す追加の 5 枚のスラブから RW の追加サンプルを採取しました (RWS と命名)。 ただし、実験期間全体 (2012 年 12 月と 2013 年 11 月) を通して、GB では毛深い根は視覚的に確認されませんでした。

異なる生育培地の物理化学的特性は、生育開始時（2012 年 12 月）と生育期中（2013 年 6 月、7 月、8 月）に測定されました。 化学分析は、Gabriels et al.35 の記載に従って実行されました。 生育培地の湿度 (w/w-%) は、Verdonck と Gabriels に従って決定されました 36。

RW および GB 培地の土壌水分保持曲線は、-1 ～ -10 kPa の圧力ポテンシャルに対してサンドボックス装置 37 を使用して確立されました。 この実験では、スラブ サンプルの 10 個の複製を使用しました。 van Genuchten 方程式のパラメーターが推定され、データがフィッティングされました 38。

増殖培地はサンプル収集から 48 時間以内に分析されました。 ５グラムの新鮮な生育培地を４５ｍｌの０．８５％ＮａＣｌ３９と混合し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ８０ブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ、Ｓｅｗａｒｄ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇ、ＵＫ）を使用して２分間均質化した。 この懸濁液を、全細胞およびアグロバクテリウム種の測定に使用した。 それぞれの媒体を考慮してください。 総細胞数を測定するために、懸濁液をシクロヘキシミド（２００ｍｇ／ｌ）を含むＲ２Ａ寒天（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ディーゲム、ベルギー）上にプレーティングした。 アグロバクテリウムのコロニーは、Shams ら 40 に従って選択および同定されました。 A. リゾゲネスは、エリスリトールおよびシクロヘキシミドを含む 320 mg/l K2TeO3 を含む 2E-Te を使用して単離されました。 28 °C で 5 日間インキュベートした後、R2A 培地と 2E-TE 培地の両方についてコロニー形成単位 (CFU) をカウントしました。 CFU の計算は Sutton41 によって概説された手順に従い、検出限界は最低希釈で 1 CFU に等しくしました。

全 DNA は、Hernandez-Sanabria らのビーズビーティング法による物理的破壊を使用して抽出されました42。 細胞をFastPrep-96ホモジナイザー(MP Biomedicals、イルキルヒ、フランス)で溶解し、DNAを冷エタノールで沈殿させ、30μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA [pH 8.0])に再懸濁した。 DNA の濃度と品質は、Nanodrop ND 1000 分光光度計 (NanoDrop Technologies、米国デラウェア州ウィルミントン) の 260 および 280 nm での吸光度に基づいて測定されました。

病原性アグロバクテリウム属の潜在的な存在。 株は、23 S rRNA 遺伝子を標的としたマルチプレックス PCR によって分析されました43。 ユニバーサルフォワードプライマー UF と、A. tumefaciens (biovar 1)、A. rhizogenes (biovar 2)、A. vitis および A.rubi に特異的な 4 つのリバース プライマーを使用しました。 PCR の条件は他の場所で説明されています 43。 プライマーペア UF/B1R、UF/B2R、UF/AvR、および UF/ArR を使用して、それぞれ 184、1066、478、および 1006 bp 長のフラグメントを増幅しました44。 病原性プラスミドの検出により、根形成性 (Ri) プラスミド上に位置する virC 病原性遺伝子の存在が明らかになりました 45。 virC 遺伝子検出のための PCR 条件は Kuzmanović ら 44 に従いました。 無作為に選択された野生型分離株で追加の確認が行われました。 コロニー PCR は、上記のプロトコールを使用して適用されました。

細菌の 16 S rRNA 遺伝子の V3 領域 (約 200 bp) の PCR 増幅は、Øvreås らによって記載されているように、ユニバーサル細菌プライマーを使用して実行されました 46。 PCR 産物はフィンガープリンティング分析の前に精製され、Bio-Rad DCode ユニバーサル突然変異検出システムを使用して、6% ポリアクリルアミドゲルを使用し、30 ～ 50% の直線変性勾配で 1 × TAE バッファー (AppliChem、ダルムシュタット、ドイツ) 上で DGGE を実行しました。 (BioRad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)。 BioNumerics ソフトウェア バージョン 5.1 (Applied Maths、Sint-Martens Latem、ベルギー) を使用した実行条件と分析は、Hernandez-Sanabria らによって報告されました 42。 増殖培地で検出されたすべての細菌の系統型を含む新しいバンド カテゴリが作成されました。 毛状根を持つサンプルにのみ存在する系統型の頻度は、R48 でフィッシャーの正確確率検定を実行するための Hernandez-Sanabria ら 47 の方法論を適用して決定されました。

16 S rRNA 遺伝子の V5-V6 領域は、報告されているプラ​​イマーを使用して増幅されました 49。 ライブラリーは、固有のバーコードでタグ付けされた等モル比のアンプリコン (各サンプル 200 ng) をプールすることによって調製されました 50。 得られたライブラリーは、MiSeq (Illumina、米国カリフォルニア州ヘイワード) でペアリングおよび結合してシーケンスされましたが、最終分析にはフォワードリードのみが選択されました (140 nt)。 リード長の 10% のスライディング ウィンドウを実行し、FASTQ ファイルの Phred 品質スコアに基づいてローカル平均スコアを計算する品質フィルター プログラムを使用して、品質を下回るリードの 3' 末端をトリミングしました。スコアは 10。配列内に N 文字を含むリード、プライマーおよびバーコード内のミスマッチ、または 8 つを超えるホモポリマー ストレッチは廃棄されました。 プライマー配列のトリミング後、バーコードに基づいて配列を分離しました。 代表的な系統型の数は、USEARCH51 の Uclust アルゴリズムを使用して、シアノバクテリア、真核生物、および古細菌の系統を除去し、少なくとも 80 の信頼水準で 97% の類似性 (1 つの不一致) でクラスタリングすることによって生成されました。 フィルタリングされたデータベースには、少なくとも a) 1% を超える存在量で 1 つのサンプル、b) 0.1% を超える相対存在量でサンプルの 2%、および 3) 任意の存在量レベルでサンプルの 5% に存在する系統型のみが含まれていました。 したがって、合計 475995 の読み取りが得られました。 データセットの配列構成は、RDP Classifier ツール 52 と SILVA データベース 53 を使用して比較されました。 リード数を調べた後、R54 の phyloseq パッケージを使用してデータを選択した最大深さ 17135 配列までランダムに希薄化し、R55 の vegan パッケージを使用して希薄化曲線をプロットしました。 上位 12 分類群の相対存在量を、科レベルまでの可能な限り深い RDP 分類とともに決定し、棒グラフとしてプロットしました 56。 OTU が家族レベルまで分類されていない場合は、NCBI データベースを使用してコンセンサス配列をブラストし、分類学的分類を取得しました。 各サンプル内で、種の総数、フィッシャーの多様性、シャノン指数、シンプソン指数、および逆シンプソン指数を計算して、アルファ多様性を評価しました。 Pielou の指数は、コミュニティ内の平等性の指標として使用されました。 園芸生育培地間のアルファ多様性と均一性の尺度の違いは、SAS (バージョン 9.3、SAS Institute、米国ケアリー) の反復測定混合モデルを使用し、生育培地タイプを固定効果として使用し、Tukey 検定を使用して複数の平均を比較して比較されました。 したがって、多様性尺度の違いは、時点、成長培地タイプ、または時間×成長培地の相互作用のいずれかに起因すると考えられます。 Chao 指数と Bray-Curtis 指数を使用して、コミュニティの非類似度行列を構築しました。 したがって、R55 のビーガン パッケージを使用して、コミュニティのベータ多様性を決定し、nMDS を使用してサンプル間の差異を視覚化しました。 999 個の順列による層化順列多変量分散分析 (PERMANOVA) を実行して、ベータ多様性の違いによって説明できる分散の割合を調査しました。 ANOVA は、成長培地の 1 つが他の培地よりも変動しやすいかどうかを明らかにするために適用されました 55。 細菌ファミリーの相対存在量の差異は、多重比較のための lsmeans 調整と Bonferroni 補正を備えた SAS の反復測定混合モデルを使用して比較されました。

SAS の混合モデルを使用して、各園芸栽培培地の物理化学的特性の違いを比較しました。 ピアソン相関を使用して物理化学的特性間の相互作用を決定し、有意性を P < 0.05 と仮定しました。 分析には 16 の変数 (湿度、pH、導電率、硝酸態窒素、アンモニウム態窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、硫酸塩、ナトリウム、塩化物、鉄、マンガン、A. リゾゲネス属の CFU および総細菌数) が含まれました。 ）。 多因子分析 (MFA) を使用して、ファミリーの相対的な存在量が各時点における成長培地間の差異にどのように寄与しているかを検出しました。 さらに、MFA を変数セット全体に適用して、両方のタイプの栽培培地で検出された物理的、化学的、微生物学的変数間の相関関係を評価しました。 変数の各グループは重み付けされ、結果は因子マップ 57 で説明され、対応する増殖培地 (因子) に対する各細菌ファミリー (ベクトル) の存在量の値がプロットされました。 FactoMineR パッケージ 58 の関数 MFA は R で実行されました。二部ネットワークは、正則化正準相関分析 59,60 から得られたペアごとの類似性行列を使用して推論されました。 類似性行列の値は、細菌ファミリーの相対存在量と、分析で保持された最初の成分が広がる空間に投影された増殖培地特性との間の相関関係として計算されました。 r ≥ 0.5 のしきい値を設定して 3 つの関連成分が得られ、相関する変数およびそれらがより豊富な生育培地と密接な関係で家族がプロット内に散布されました。 特定の細菌ファミリー間の関係と評価された物理的および化学的特性を確認するために、追加の認定手順である対応分析 (CA) が採用されました 47。

この記事を引用する方法: Grunert, O. et al. ミネラルおよび有機栽培培地は、無土壌培養システムにおいて独特の群集構造、安定性、機能性を備えています。 科学。 議員6、18837; 土井: 10.1038/srep18837 (2016)。

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この研究は、プロジェクト助成金 IWT Baekeland 命令 120200 およびフランダース研究財団 (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen、FWO) によって支援されました。 著者らは、Guillaume Blanchet と Joris Meys の統計的サポートに感謝します。 技術的支援についてはIris Plumeier、Silke Kahl、補足図3のアートワークについてはTim Lacoere、アドバイスについてはFrederiek-Maarten Kerckhof、Nicole Hahn、Ruben Props、Amanda K. Luther、Stephen J. Andersenに感謝します。

Grunert Oliver と Hernandez-Sanabria Emma も同様にこの作業に貢献しました。

微生物生態学および技術研究所 (LabMET)、ゲント大学、Coupure Links 653、ゲント、B-9000、ベルギー

オリバー・グルナート、エマ・ヘルナンデス＝サナブリア、ラミロ・ヴィルチェス＝バルガス、ニコ・ブーン

ゲント大学植物生産学部、Coupure Links 653、ゲント、B-9000、ベルギー

マリー＝クリスティーン・ヴァン・ラベケ＆ダーク・レウル

Peltracom NV、Skaldenstraat 7a、ゲント、B-9042、デステルドンク、ベルギー

オリバー・グルナート & マアイケ・パーニール

分子感染生物学部門、微生物相互作用およびプロセス研究グループ、ヘルムホルツ感染研究センター、Inhoffenstraße 7、ブラウンシュヴァイク、D-38124、ドイツ

ルイ・ジャウレギ & ディートマー・H・ピーパー

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実験の考案と設計: OG、EH-S.、MCVL、DR、NB 実験の実行: OG、EH-S. Illumina ライブラリ処理: RJ および RV-V。 データマイニング、統計分析、結果の解釈、図と表の作成: EH-S。 および OG 寄稿した試薬/材料/分析ツール: NB、MP、および DHP 論文を執筆: OG および EH-S。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Grunert, O.、Hernandez-Sanabria, E.、Vilchez-Vargas, R. 他ミネラルおよび有機栽培培地は、無土壌培養システムにおいて独特の群集構造、安定性、機能性を備えています。 Sci Rep 6、18837 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep18837

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受信日: 2015 年 6 月 19 日

受理日: 2015 年 11 月 25 日

公開日: 2016 年 1 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18837

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