糞便微生物便成分の分離のための密度勾配の適用とその潜在的利用

Scientific Reports volume 5、記事番号: 16807 (2015) この記事を引用

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メトリクスの詳細

腸内微生物叢を仮想の人間の器官として考えるという考え方は、糞便微生物叢移植 (FMT) の概念につながり、最近、クロストリジウム ディフィシル感染症の再発例の治療で大きな成功を収めています。 安全で生存可能な代表的な糞便微生物叢の管理は、FMT にとって非常に重要です。 私たちの知る限り、糞便サンプルから糞便微生物叢を分離するための適切な技術と体系的な条件は十分に調査されていません。 この研究では、Nycodenz® 密度勾配を用いた手順を使用して、糞便微生物を残りの糞便物質から分離し、糞便 2 グラムあたり 1010 個の生菌が得られる可能性を示します。 この手順は、系統発生学的メタゲノムアプローチによって評価されるように、生存率、分布および割合の点で元の微生物叢の組成に影響を与えませんでした。 残りの糞便成分から微生物を濃縮および分離して糞便微生物叢を取得すれば、その回収と長期保存の標準化が可能になります。 FMT または同様の微生物叢修復療法は、いくつかの疾患の治療や美容目的にも使用できる可能性があるため、私たちの研究で説明されている方法は、安全で標準化された製品の開発の基礎の確立に貢献する可能性があります。

ヒトの消化管 (GI) は、常在微生物叢と栄養素が宿主細胞と継続的に相互作用する複雑な生態系です1。 腸内細菌叢は数兆個の細菌で構成されており、その数は私たちの体の真核細胞よりも 1 桁多く 2、腸内細菌叢を仮想臓器として考えるという考えが科学界で人気を集めています 3。 私たちの腸内細菌叢によって提供される遺伝子は「腸内細菌叢」と呼ばれますが、「ヒトマイクロバイオーム」（理論的には、私たちの体に生息するすべての微生物の遺伝子相補体）という用語が同義語として使用されることもあります4。 およそ 10,000,000 個の固有の遺伝子があり、特に 21,000 個の人間の遺伝子という「控えめな」数を上回っています 5,6。私たちの腸内細菌叢は、他の方法では代謝できない栄養素を利用する能力を含め、私たちの生体にはない代謝特性を補っており、短鎖脂肪酸やビタミン、その他多くの物質7. それどころか、人間の宿主は微生物叢に栄養素を提供します。つまり、私たちのGIは、各個体が独自の有益な微生物を養殖する一種の微生物園です。

ここ数年の間に、ハイスループットシークエンシング技術とその腸内微生物群集の研究への応用が大きく進歩し、腸内微生物叢が免疫系の成熟の成功と人間のさまざまな側面に重要な影響を与えているという証拠が増えてきています。生理機能には、いくつかの病気の誘発、進行、確立が含まれる場合があります。 腸内微生物叢のプロファイルは食事8、9、年齢10、または地理11の影響を受けるだけでなく、腸内微生物構成の変化は、肥満12、メタボリックシンドローム13、関節リウマチ14、1型糖尿病15、炎症性腸などの一部の腸疾患および自己免疫疾患と関連していると考えられています。疾患16および全身性エリテマトーデス（SLE）17。

人間の微生物叢が私たちの臓器のもう 1 つであることに同意するなら、糞便微生物叢移植 (FMT) の概念がすぐに浮上します。 科学文献では、FMT は 1950 年代後半に初めて記載され 18、「浣腸、結腸内視鏡検査、またはその他の手段によって、健康な人から処理された便を病人の腸に送り込むこと」19 と定義できます。 注目すべきことに、FMT は、抗生物質治療に反応しなかった感染者の腸からの再発性クロストリジウム ディフィシル感染症の排除と、バランスのとれた腸内細菌叢の再確立において、印象的な有効性 (場合によっては 90% 以上の成功) を示しました。 ごく最近、FMT は抗生物質誘発性大腸炎の治療に適用されることに成功しました 21。 特定の集団における規制されていない FMT の一般化により、米国食品医薬品局 (FDA) は糞便を生物学的医薬品として厳しく規制するようになりました 22。

人間の腸の健康に対する FMT のこれらの特性は、有名なソーシャル ネットワークやブログに何千ものエントリーが掲載されるなど、社会に大きな影響を与えてきました。また、FMT の適用促進に特化した財団やその他の非営利組織の設立も含まれます (例: http://thefecaltransplantfoundation.org/、http://thepowerofpoop.com/、http://www.openbiome.org/)。 FMT の現在の方法には、新鮮なドナーの糞便をその日のうちに処理することが含まれています。 しかし、精密濾過によって腸内微生物叢を残りの糞便物質から分離し、例えばその保存を可能にするためのいくつかのプロトコルが公開されている23。 このプロトコールに従って、腸内細菌叢はまず凍結保護剤の存在下で精密濾過され、次に-80 °C で凍結されます。 16S rRNA 遺伝子プロファイリングによって証明されているように、この微生物調製物は、クロストリジウム ディフィシルの排除に対して新鮮な糞便調製物と同様に有効であることが示されています 24。

再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症以外にも、FMT の潜在的な応用例は多数ありますが、健康な糞便微生物叢の正常化と標準化については研究が必要です。 第一に、制御された条件下で微生物叢を抽出し、残りの糞便物質から分離することは、糞便の魅力のない性質を回避するのに役立つ可能性がある。 第二に、これにより、糞便微生物叢の長期保存が可能になり、抽出後何年も経っても、バイオリアクター内での繁殖が可能になります。 さらに、ウイルス（HIV、肝炎など）、寄生虫、その他の望ましくない微生物の便スクリーニングなどの作業も容易になります。

この研究では、密度勾配を使用した糞便微生物叢の分離手順の適用について説明します。 16S rDNA メタゲノム プロファイリングを使用して、微生物群集全体の構造が糞便から分離された後も変化していないことを確認しました。 腸内細菌叢の長期保存のためのこの方法の潜在的な応用についても説明します。

この研究の倫理承認は、スペイン経済競争省のプロジェクト AGL2010-14952 (「一部の免疫疾患における腸内微生物叢の機能のより良い理解に向けて」) の枠組みの中で得られました。 最終承認は、ヘルシンキ宣言に従って、CSIC の生命倫理委員会 (Consejo Superior de Investigaciones Centíficas) および臨床研究地域倫理委員会 (Servicio de Salud del Principado de Asturias) から得られました。 すべての測定は、研究に参加したすべての参加者から十分な情報を与えた上で書面による同意を得て実施されました。

この研究の便サンプルは、全身性エリテマトーデス (SLE) 患者 5 名と、SLE に関連する腸内細菌叢の異常が記載された以前の研究から選ばれた健康な対照 3 名から採取されました 17。 これらの参加者からの詳細な臨床データと栄養データは、上記の研究で取得できます。 SLE患者は、サンプル採取前の6か月間、抗生物質、グルココルチコイド、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、またはその他の免疫療法を使用していません。

いくつかの修正を加えたクルトワらの方法に従って、微生物叢を残りの糞便物質から分離するために、各糞便サンプルの一部を密度勾配にさらした25。 ２グラムの糞便を、実験室用パドルブレンダー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００、Ｓｅｗａｒｄ Ｌｔｄ．英国）中で１８ｍＬの滅菌ＮａＣｌ ０．９％（ｗ／ｖ）中で１分間均質化した。 Nycodenz® 80% (w/v) (PROGEN Biotechnik GmbH、ハイデルベルク、デンマーク) の溶液を超純水で調製し、121 °C で 15 分間滅菌しました。 10.5 mL の希釈し、均質化した糞便サンプルを 3.5 mL の Nycodenz® 溶液の上に置き、4 °C で 40 分間遠心分離しました (10,000 × g、TST41.14 ローター、Kontron、ミラノ、イタリア)。 可溶性残骸を含む上相を遠心分離ステップ後に廃棄し、10.5 mLのPBSで抽出した微生物叢に対応する層を収集しました（図1）。 不溶性破片を沈殿させるために、細胞懸濁液を氷上に 5 分間保持し、その後 2 回洗浄し、DNA 抽出を行うまで 1 mL ずつに分けて -80 °C で保存しました。 すべての場合において、以前の研究で説明されているように、QIAamp DNA Stool Mini キット (Qiagen Ltd.、Strasse、Germany) を使用して、均質化された便サンプルから直接、または対応する分離された微生物叢画分から DNA が抽出されました 26。

この作業で使用される実験セットアップのワークフロー。

(A) 材料と方法のセクションで説明したように、希釈して均質化した糞便サンプルを Nycodenz® 溶液の上にロードしました。 (B) 遠心分離後、4 つの層が形成されました。 位相差顕微鏡で層の内容を調べることにより、ナイコデンツの上に可溶性（上部）と不溶性（下部）の糞便破片を含む2つの層の間に、糞便微生物叢に対応する1つの層が存在することを確認できました。 (C) 微生物相層の光写真。微生物のサイズと形状の多様性が高いことを示しています。 バー、10μm。

微生物叢抽出の収量を評価し、回収された微生物叢の生存率を確立するために、3 人の健康なドナーからの 3 つの追加の糞便サンプルを密度勾配抽出の前後にフローサイトメトリーで分析しました。 細菌の計数のために、細菌計数キット（InvitrogenTM、Life Technologies、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を備えたフローサイトメーター（Cytomics FC500、Beckman-Coulter Inc.、フロリダ州マイアミ）を使用してサンプルを測定しました。 サンプルの絶対計数値は、最小 2,000 個、最大 10,000 個の蛍光標準ビーズを使用し、ビーズに対応する領域の分析に従って決定されました: 生きた細菌 (Syto9 で染色) と死んだ細菌 (ヨウ化プロピジウムで染色)シグマ、ミズーリ州セントルイス）。 トリガーシグナルは側方散乱 (SSC) 検出器 (細菌計数キット、Invitrogen で推奨されているとおり) で確立され、蛍光シグナルは Syto9 の場合は FL1 検出器 (510 ～ 550 nm)、プロピジウムの場合は FL4 検出器 (660 ～ 700 nm) で収集されました。ヨウ化物。 精密濾過したPBSを陰性対照として使用した。 さらに、死んだ微生物叢の対照として、糞便サンプルのアリコートを 98 °C で 10 分間、さらに UV 光照射下で 15 分間処理しました。 各サンプル中の微生物叢の生存率は、Nycodenz® 抽出手順の前後の糞便微生物叢内の生菌の割合として計算されました。 細菌の絶対数は、供給業者の推奨するレシオメトリック計数に従って、各サンプルの内部標準として蛍光ビーズを使用して計算されました。 相対濃度は、総乾燥糞便のグラム数に対する細菌の絶対数として表され、FIL-IDF 規格に従って決定されました 27,28。

部分的な 16S rRNA 遺伝子アンプリコンは、我々の研究グループの以前の研究に記載されているように、プライマー Probio_Uni および Probio_Rev (V3 および V4 領域を標的とする) を使用して PCR によって取得しました 17,26。 Ion Sequencing 200 キット (Life Technologies、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して配列ライブラリーを精製 PCR 産物から調製し、GenProbio Ltd 施設 (http://www.genprobio. com）。 シーケンス後、低品質配列やポリクローナル配列などの特定の配列リードグループが PGM ソフトウェアによって削除されました。 PGM 3' アダプターに一致する配列も自動的にトリミングされました。 PGM の品質が承認され、トリミングおよびフィルター処理されたすべてのデータは、.sff ファイルとしてエクスポートされました。

.sff ファイルは、以前の研究 26、29 で説明したスクリプトと手順を使用して QIIME 1.7.0 を使用して処理されました。 150 ～ 200 bp の長さの配列リード、および平均配列品質スコアが 25 より高い配列リードのみが品質管理の一部として保持されました。 低品質のローリング 10 bp ウィンドウが見つかった場合、配列は最初の塩基でトリミングされ、ホモポリマー (> 7 bp) やミスマッチプライマーを持つ配列などの他の配列が省略されました。 下流の多様性尺度（アルファおよびベータ多様性指数、Unifrac 分析）を計算するために、16S rRNA 操作分類単位（OTU）を 97% 以上の配列相同性で定義し、Chimera Slayer30 を使用してキメラ配列を除去しました。 すべてのリードは、QIIME と GreenGenes の参照データセット (バージョン 13.5、2013 年 5 月、http://greengenes.secondgenome.com) を使用して、可能な限り最も低い分類ランクに分類されましたが、一般に、家族レベルが研究全体で考慮された最も低い分類単位でした。 OTU は、QIIME で提供されるスクリプト pick_de_novo_otus.py を使用して uclust を使用して割り当てられ、ダウンストリーム分析用に BIOM 形式でエクスポートされました31。 QIIME が提供する alpha_diversity.py スクリプトを使用して、BIOM 形式のテーブルからさまざまなアルファ多様性メトリクス (チャオ、観察された種、シャノン、シンプソン) を計算しました。

密度勾配抽出の前後の 16S rRNA 遺伝子プロファイルを 4 つの分類レベル (門、綱、目、科) で評価しました。 サンプルは、ソフトウェア PAST v3.032 に実装された 3 つの異なる教師なし多変量解析、主成分分析 (PCA)、主座標分析 (PCO)、およびコレスポンデンス分析 (CA) を使用して、微生物プロファイルに従って順序付けされました。 注文後、サンプルは DNA 抽出に使用されたサンプルの種類 (Nycodenz® 密度勾配で分離された糞便と微生物叢) に応じて分類されました。 多変量データに対して、一方向 ANOSIM および一方向 PERMANOVA などのさまざまな統計検定が実行され、それぞれに 9,999 の順列がありました。 単一の分類グループの違いを評価するために、BIOM 形式の OTU テーブルが 4 つの分類レベルで折りたたまれ、タブ区切りのテキスト形式でエクスポートされ、STAMP v2.0.333 を使用して分析されました。 分類群と DNA 抽出に使用したサンプルの種類の関連性は、すべての平均値ペアで両側ウェルチ検定を実行することによって評価されました。 偽発見率補正 34 が最終的に適用され、以前の研究と同様に、2 つの実験条件間の分類群の有意差は、p 値 0.05 未満および q 値 0.2 未満のみとみなされました 17,35。 最後に、Jaccard インデックスを使用した類似性行列が、PAST v3.0 を使用して家族レベルのすべてのサンプルに対して取得されました。 サンプル間の類似性は、Simple Linkage 法または Neighbor Joining アルゴリズム (9,999 回の繰り返しを使用) で構築された樹状図で表されました。

ここ数年の間に、ヒトの腸内細菌叢の構成を理解することへの関心が高まったことで、これらの微生物集団が特定の疾患、特に自己免疫性や炎症性の要素を伴う疾患の枠組みにおいてどのように変化するのかについて、より多くの知識が得られてきました。 腸内細菌叢は、人体の動的な臓器であるため、治療目的で移植されやすいと考えられ始めています。 報告されているすべての FMT 投与経路および投与手段において、糞便物質 (新鮮または凍結) は、通常は制御されていない雰囲気下で生理食塩水で希釈されるか、凍結乾燥されます。

密度勾配ベースの方法論を使用した糞便からの微生物の分離は、1970 年代以来土壌から細菌を分離するために使用されてきたため、新しい概念ではありません。 最初の分離プロトコルは、異なる緩衝液と塩溶液での混合と遠心分離のステップを繰り返すことから構成されていました 36,37。 その後、改変されたスクロース勾配での遠心分離による細菌の分離 38 または陽イオン交換樹脂を通過させることによる細菌の分離 (Jacobsen and Rasmussen、1992) が提案されました 39。 これらのプロトコルの主な制限は、時間がかかるため、日常的な分析での実装が難しいことです。 この制限は Nycodenz 樹脂 25 を使用することで克服されますが、細菌の生存率に関するデータは示されていません。 FMT の枠組みでは、消化管微生物叢を残りの糞便物質から分離すると、糞便の魅力のない性質による衛生上の懸念が軽減されるという利点が得られます。

この研究では、SLE17 の枠組みにおける腸内細菌叢の異常に対処する以前の研究研究から 8 つの糞便サンプルが選択されました。 これらのサンプルは、ファーミクテス対バクテロイデス比のさまざまな値に反映されるように、細菌の多様性に関して多様でした（FBR、健常対照と比較してSLE患者の方が低い; HC4 = 8.6、HC32 = 8.8、HC33 = 4.5、SLE2 = 1.6、SLE12 = 1.0、SLE13 = 1.6、SLE21 = 1.2、SLE22 = 0.3)。 興味深いことに、FBR の変化は、クローン病、ヒト 2 型糖尿病、肥満などの特定のヒト疾患で観察されています。 この選択の根底にある理論的根拠は、私たちの抽出方法が異なる FBR を持つサンプルに干渉する可能性があるかどうかを評価することでした。

私たちのアプローチでは、均質化した糞便希釈液を 80% w/v Nycodenz® 溶液の上にロードし (図 1A)、10,000 × g で遠心分離しました。 これは、Nycodenz® 勾配の準備と相対遠心力の値が異なる、Murayama et al.41 の方法論に従った Rooijers et al.40 のアプローチとは異なりました。 微生物叢は、1 回の遠心分離ステップで残りの糞便物質から分離されました。 図 1B に見られるように、微生物バイオマスに対応する 2 つの層が不溶性デブリ層の上部に観察されました。 この破片は、再懸濁した微生物叢と下層の Nycodenz® 層との混合を避ける物理的障壁となるため、可溶性破片の上相が除去された後の微生物の回収作業を容易にしました。 異なる層をコントラスト位相顕微鏡に供したところ、微生物の大部分が上記の 2 つの層で観察されました (図 1C)。

Nycodenz® 抽出手順の効率を評価するために採用されたアプローチは、密度勾配で分離された糞便微生物叢の生存率が、新鮮な糞便微生物叢と比較して十分に維持されることを示しました (補足図 1)。 平均して、Nycodenz® 処理後に回復した微生物叢では、細菌の 66.9% がまだ生きており、分析した 3 つの糞便サンプルの値は 71.3 ～ 60.6% (66.9 ± 5.6) でした。一方、新鮮な糞便では、生存率は次のように推定されました。 85.6 ～ 49.9% (68.6 ± 17.9) の範囲。 これは、湿度や繊維含有量に関する糞便の変動に関係なく、生存微生物叢の濃縮と分離のために提案された方法論の効率の良さを示しています。 フローサイトメトリーで分析した 3 つのサンプル中の生細菌の濃度は、新鮮な糞便の元のサンプルでは 3.2 × 109 ～ 7.2 × 109 (5.2 ± 2.0 × 109) 細菌/グラム糞乾物、および 5.7 × 109 ～ 9.0 の範囲でした。密度勾配抽出後の糞便 1 グラムあたり × 109 (7.0 ± 1.8 × 109)。 これは、すべての生菌が糞便物質から抽出され、糞便サンプル 2 グラムあたり約 1010 個の生菌が得られることを意味します。 処理前後の平均濃度に有意差は見られなかった。 したがって、我々の結果は、異なる個々のドナー間で回収された生存微生物叢のばらつきが最小限であり、糞便細菌の完全性に対する分離プロトコルの影響がないことを示しました。

密度勾配を使用して抽出された微生物叢画分の分析では、糞便から直接抽出された DNA から得られた結果と比較すると、多様性が全体的に減少しました。 これは、種の豊富さのみを考慮したアルファ多様性指数 (Chao 1、観察された種) を計算した場合には当てはまりましたが、種の均一性 (シャノン) を考慮したシャノン指数を使用した場合にはその逆が観察されました (図 2)。 。 シンプソン指数を使用しても、アルファ多様性の違いは検出されませんでした。 全体として、これは、Nycodenz® 抽出後に回収された OTU の数は減少しているものの、OTU 間の比率は抽出プロセス中に必ずしも変化していないことを意味します。 α多様性の減少は、腸内毒素症のバランスに重要な正確な細菌群が失われる可能性があるため、FMTの有効性に影響を与える可能性があるという意味で注意が必要です。 このように、OTU/種の減少の一部が、密度勾配における微生物叢分離の操作中の酸素曝露によるものであるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。 糞便微生物叢の抽出が厳密な嫌気性条件下で実行される場合、酸素の影響を受けやすい特定の微生物の種類が保護される可能性があります。 Nycodenz® 勾配が、毒素、プリオン、ウイルスなどの望ましくない分子/微生物を糞便から選択的に除去するのに役立つかどうかを解明することも興味深いでしょう。

密度勾配による微生物叢の分離前 (濃い灰色) または分離後 (薄い灰色) の便サンプルから得られた、さまざまなアルファ多様性指数。

棒は平均±標準偏差を表します。 (*p < 0.05; ***p < 0.001)。

Nycodenz® 抽出の有無にかかわらず、サンプル間で微生物の多様性に観察された差異がクラスタリングの目的に使用できるかどうかを知るために、さまざまな方法論を通じて、門または科レベルでの分類学的組成を使用してサンプルを順序付けしました。 主成分分析 ( PCA）、主座標分析（PCoA）、およびコレスポンデンス分析（CA）（図 3）。 公平な方法で、つまり、さまざまな微生物プロファイルのソースに関する情報を提供せずに使用した場合、すべての順序付け方法でサンプルを別々のグループ（糞便対抽出微生物叢）にクラスター化することができました（図 3）。 抽出法の効果がないことは、一元配置 ANOSIM や一元配置 PERMANOVA などのノンパラメトリック検定を使用することで、事後的に統計的に維持されました。 どちらの場合も、サンプルはまずその起源に従って分類され、それらの類似性はユークリッド距離に従って測定されました。 得られた p 値は、サンプルを 2 つのグループに分類することを裏付けませんでした (糞便 vs 抽出微生物叢; 一元配置 ANOSIM; p 値 0.733; 一元配置 PERMANOVA; p 値 0.353)。

微生物集団が均質化された便サンプルから直接得られたもの（黒い点）なのか、分離された糞便微生物叢から得られたもの（灰色の四角）なのかを決定するために、さまざまな偏りのない多変量順序付け方法論が使用されました。

楕円は、人口ポイントの 95% が含まれると予想される推定領域を表します。 分析は門および家族レベルで実行されました。 PCA: 主成分分析。 PCoA、主座標分析。 CA、対応分析。

16S RNA 遺伝子プロファイリングにおける密度勾配による微生物の分離の影響をさらに研究するために、他のメタゲノム研究ですでに使用されている方法である Jaccard 距離を計算することにより、相対的なファミリー存在量を使用した類似性行列を構築しました 42。 サンプルは、Simple Linkage 法または近隣結合アルゴリズムによるサンプル間距離を使用してクラスター化され、対応する樹状図が得られました (図 4)。 どちらの場合も、サンプル LS12 と HD33 を除き、微生物叢の分離後に DNA が抽出されたサンプルは、対応する糞便サンプルとクラスター化されました。 これらのサンプルでは、​​メタゲノム プロファイルに対する微生物叢抽出の効果がより高く、一部のグループでは門または家族レベルで劇的な変化が見られました (補足図 2)。 これらの結果は、原則として、密度勾配遠心分離手順を使用して抽出された微生物群集が、元の糞便サンプル中に存在する微生物群集を代表するものであることを確認した。

Jaccard 距離に応じたサンプルの類似性を示す樹状図。 (A) 単純な連携によるクラスタリング。 (B) ブランチサポート付きの近隣結合を使用したクラスタリング (10,000 回の繰り返し)。 NEW および OLD の接尾辞は、それぞれ DNA 抽出前に密度勾配で微生物叢が抽出されたサンプルまたは抽出されなかったサンプルを示します。

Nicodenz® 密度勾配を使用した微生物の分離は、Lindahl と Bakken43 によって土壌から細菌を分離するために初めて導入されました。 この方法は、アカヤシゾウムシ (Rhynchophorus ferrugineus) の腸メタゲノムの記述 44 や乳製品マトリックスにおける遺伝子発現評価 45 など、他の生物学的システムにも適用されて成功しています。 特定のマトリックス化合物から細菌を分離することは、このステップにより、フミン化合物やブロットハイブリダイゼーションプロトコルを妨げる着色物質など、PCR を阻害する成分の多くが除去されるため、下流の分子生物学の応用に非常に役立つ可能性があります46。

私たちの研究では、この方法論の適用は、抽出された微生物叢の全体的な変動に影響を及ぼさないことが示され、γ-プロテオバクテリア 25 を除いて、土壌から直接抽出された細菌または Nycodenz® 勾配に従って抽出された細菌の多様性に大きな違いはありませんでした。 ただし、サンプル全体をグループ化して分析した場合、一部の分類グループは勾配抽出に従って有意な変動を示しました (表 1)。 一般に、Nycodenz® 勾配で微生物叢を抽出したサンプルからの 16S rRNA 遺伝子プロファイルは、Firmicutes 門の相対存在量が高いという特徴があり、これはクロストリジウム目目の回収率が高いためです (補足図 3)。 プロテオバクテリア門のベータ、デルタ、イプシロン部門を構成するいくつかのグループも、程度は低いものの、治療に応じて有意な変動を示しました。

一般に、この研究で提示された方法論は、糞便微生物叢を残りの糞便成分から抽出して分離するためのシンプルで直接的な方法を提供し、制御された大気条件下でこのプロセスを実行するなどのさらなる改善が可能になります。 さらに、この抽出ステップにより、糞便に含まれる一部の望ましくない化合物が除去される可能性がありますが、これについてはさらなる研究が必要です。 私たちのアプローチは、長期保存目的で便物質を含まない代表的な腸内細菌叢を取得するのに役立つ可能性があります。 これは、微生物群集全体を保存するための最初のステップとしても役立つ可能性があり、近い将来、FMT や新しい腸修復生物療法のための微生物叢に基づく製品/媒体の設計に使用される可能性があります。 ただし、たとえば、一部のクロストリジウム関連 OTU は Nycodenz® 抽出によって顕著な影響を受け、C. scindens などのこの属の一部のメンバーは CDI 処理に関連する可能性があるため、この方法のさらなる改善が必要です 47。 さらに、この方法に従って抽出された微生物叢が宿主に効果的に生着されることを示すためには、動物実験が必要です。

興味深いことに、このプロトコルはスケールアップでき、より高い容量の遠心装置を使用して大量の糞便を処理できるようになります。 たとえば、4 × 1000 mL バケツを割り当てたスイングローター (最大 30,000 × g) を使用して 430 グラムの糞便物質を処理でき、予想される生菌数は 1012 です。

要約すると、この研究で説明されている Nycodenz® 密度勾配を使用して健康なドナーの糞便から代表的な微生物叢を取得すると、高い生存レベルを維持しながら、腸内微生物叢を集中させ、残りの糞便成分から分離した状態を保つことができます。 一方で、Nycodenz® は人体への毒性という点では安全な分子であり、微生物叢の抽出プロセスでサンプルから簡単に除去できます。 密度勾配分離に使用される他の分子に関して、X 線高密度化合物 Nycodenz® は、ほとんどの酵素の活性に対する非阻害効果、タンパク質定量アッセイへの適合性、および目的に関連するものなどの利点を示します。この論文によれば、ヒトに対する毒性は低いことが示されています41。 一方、密度勾配により、代表的な生存可能な糞便微生物叢の回収と、望ましくない微生物/化合物の抑制が可能になるだけでなく、サンプルの有害物質の検査が容易になります。 これにより、特定の疾患の枠組みまたは他の応用の両方において、微生物による腸修復のための微生物叢に基づく治療戦略などの下流応用の開発が可能になる可能性がある。

この記事を引用する方法: Hevia, A. et al. 糞便微生物便成分の分離のための密度勾配の適用とその潜在的な使用。 科学。 議員 5、16807; 土井: 10.1038/srep16807 (2015)。

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この研究は、スペインの「Plan Estatal de I+D+I」のGrants AGL2010-14952、AGL2013-44039-R、AGL2013-44761-P、およびBIO2014-55019-JIN、および「Plan」のGrant EM2014/046によって資金提供されました。調査研究、革新と創造 2011 ～ 2015 年」。 ボルハ・サンチェス氏とアランチャ・ヘビア氏は、それぞれスペイン経済・競争力省からラモン・イ・カハル博士研究員契約とFPI助成金を受け取った。

乳製品の微生物学および生化学部門、乳製品研究所 (IPLA-CSIC)、パセオ リオ リナレス s/n、33300 Villaviciosa、アストゥリアス、スペイン

アランチャ・ヘビア、スサナ・デルガド、アベラルド・マルゴレス、ボルハ・サンチェス

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AMとBSがこの研究を発案した。 AH、SD、BS は実験を実行し、主要な原稿テキストを書きました。 著者全員が原稿をレビューしました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Hevia, A.、Delgado, S.、Margolles, A. 他糞便微生物便成分の分離のための密度勾配の適用とその潜在的な使用。 Sci Rep 5、16807 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep16807

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受信日: 2015 年 4 月 1 日

受理日: 2015 年 10 月 20 日

公開日: 2015 年 11 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16807

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