メタトランスクリプトミクスで温度が明らかになる

Scientific Reports volume 6、記事番号: 21871 (2016) この記事を引用

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メトリクスの詳細

伝統的なチーズには、典型的な感覚特性を形成する上で重要な役割を果たす複雑な微生物共同体が存在します。 しかし、微生物の代謝を制御することは難しいと考えられています。 伝統的なイタリアのチーズの熟成中に微生物群集の継承と関連遺伝子発現が分析され、熟成を促進するために修正できるパラメーターが特定されました。 その後、熟成条件を調整し、微生物群集の構造と機能の一貫した変化を観察しました。 私たちは、熟成関連活動における非スターター乳酸菌の重要な貢献の具体的な証拠を提供します。 熟成温度の上昇により、タンパク質分解、脂肪分解、アミノ酸/脂質異化に関連する遺伝子の発現が促進され、チーズの熟成速度が大幅に増加しました。 さらに、温度によって促進される微生物の代謝は、チーズ中のタンパク質および揮発性有機化合物のメタボロームプロファイルと一致していました。 この結果は、生産効率と製品品質を最適化するために、処理によるマイクロバイオーム応答をどのように調整できるかを明確に示しています。

チーズは生物学的および生化学的に動的なマトリックスであり、微生物叢の構造と活動は製造方法や環境条件の影響を受けます。 伝統的なチーズは、広範な遺伝的多様性を持つ自然に選択されたスターター培養物を使用するか、スターターを使用せずに使用されます1、2。 したがって、伝統的なチーズには、バックスロッピング手順に従って使用される未定義の天然ホエイ培養物 (NWC) の使用から生じる豊富で複雑な微生物叢が含まれていますが、生乳や乳製品環境からも生じます 3。認識されていますが、多くの場合、十分に調査されていません。 チーズの製造は、一連の異なる乳酸菌 (LAB) 種によって特徴付けられます。 カードの酸性化は主に好熱性 LAB、主に Streptococcus Thermophilus、Lactobacillus delbrueckii、Lb によって促進されます。 helveticus2,4,5、一方、中温性ノンスターターLAB (NSLAB)は熟成中に引き継ぎ、チーズの風味と食感の発達に関与する可能性があります6,7,8,9,10,11。 微生物叢は、チーズの典型的な感覚特性を形成する上で重要な役割を果たしています12、13。 それにもかかわらず、これらの複雑な微生物群集は制御が難しいことが多く、チーズ製造中および熟成中のそれらの動態と進化を簡単に予測することはできません。 チーズの熟成中の微生物の挙動と、適用される技術的パラメーターがチーズ製造のダイナミクスと最終製品の品質にどのような影響を与えるかを理解することは、安全性と品質を確保するための極めて重要なステップです3,14。 さらに、微生物の活動の調節を通じて熟成速度を加速することは、伝統的で小規模な、より工業化された酪農場にとって非常に重要です。 この制御により、運用コストを削減し、熟成室の回転率を高め、チーズの品質を優先してプロセス効率を最適化できます。 マルチオミックアプローチを使用してチーズ製造中の動的な微生物の生態と代謝を研究することは、効率の向上に役立つ可能性があります14,15。 メタトランスクリプトミクスは、モデルチーズにおける接種菌株培養の研究に最近使用されています 16,17 が、複雑なコミュニティの転写ダイナミクスはまだ解明されていません。 一方で、発酵食品の微生物群集は他の自然環境ほど複雑ではなく、微生物集合の動態や微生物群集が非生物的要因によってどのように操作されるかを研究するための再現可能で扱いやすいシステムである可能性がある18。

伝統的なイタリアのカチョカヴァッロ シラノ チーズの熟成中に、微生物群集の構造と遺伝子発現の縦断的特性評価が行われました。 これは、天然スターターとして NWC を添加して製造される典型的な中熟パスタフィラータ チーズです。 ここで報告されている初期調査では、熟成を促進するために変更できるパラメーターが特定されました。 そこで、我々は 2 番目の実験を設定しました。そこでは、熟成条件が調整され、微生物群集の構造と機能の一貫した変化が観察されました。 私たちは、熟成温度の上昇が微生物の代謝にどのような影響を及ぼし、チーズの熟成速度を大幅に高めるかを明らかにします。

チーズの熟成は 2 つの別々の実験で調査されました。 まず、微生物群集構造 (16S rRNA アンプリコン) 分析と遺伝子発現の浅い調査 (メタトランスクリプトミクス) が、生乳および加熱牛乳、天然ホエイ培養物、5 時間発酵後および伸長前のカード、塩漬け後および浸漬中のチーズに対して実行されました。 0日、10日、20日、30日、60日で熟成します。 このようにして、パスタフィラータチーズの製造および熟成中にどの細菌の活動/経路が高度に発現しているかを特定し、熟成を促進する方法を理解するために必要なパラメーターを提供しました。

次に、3 つの異なる条件で熟成させたチーズについて、30 日間にわたるマイクロバイオームを特徴付ける 2 番目の実験を設定しました: (A) 乳製品の標準条件 (16 °C および 75% RH)、(B) 温度を 20 ℃に上昇°C および (C) 相対湿度を 65% に下げる。

最初の実験では合計 3.3 Gbp、2 番目の実験では 19.8 Gbp を取得しました。 最初の実験では、サンプルあたり平均 876,295 リード (±409,657) が得られ、リードの平均 22% が参照ゲノム (12 ～ 27.8% の範囲) に一意にマッピングされました。

2 番目の実験では、平均 1,180,7044 リード/サンプル (±590 万) と、リードの平均 35.5% (23.9 ～ 58.6% の範囲) が一意に参照ゲノムにマッピングされました。 各種で同定された遺伝子の正規化された存在量（100万あたりの読み取り）およびOTU相対存在量（％）は、補足表S1およびS2として報告されます。

チーズの熟成は、少数の非スターター乳酸菌、例えば、Ｌｂ． カセイとLb. ブフネリ、クラストと比較してチーズの中心部の存在量が多かったグループ。 この結果は、この研究で実行された両方の実験で一貫していました。 ファーミクテスは、コアとクラストの微生物叢を最も顕著に区別した門でした（補足図1）。 30℃でインキュベートしたMRS寒天培地上の微生物負荷は熟成中に増加し、チーズコアの値が大きくなりましたが、好熱性乳酸菌と連鎖球菌は徐々に減少しました（補足表3）。 3 つの異なる熟成条件を比較した場合 (2 番目の実験)、対照条件と比較して、相対湿度が低下したとき (C – 17.2%) と熟成温度が上昇したとき (B – 15.3%) に、熟成 10 日目の NSLAB が大幅に多くなりました。 (A–8.3%) (P < 0.05)。 しかし、相対湿度が低下した条件 (C) では、NSLAB 存在量は 10 日間の熟成後に急速に減少しました。 興味深いことに、Lb. 対照条件では検出されなかった発酵菌が、昇温条件（B）では 10 日後に出現し、熟成中ずっと増加し続けました。

最初の実験の結果は、成型して塩漬けした後のカードとチーズには、炭水化物代謝に関与する遺伝子が蔓延しているという特徴があることを示しました。 熟成中、チーズクラストでは炭水化物代謝（ペントースリン酸経路、解糖）と細胞分裂（遺伝情報処理と核細胞プロセス）が強化され、チーズコアではアミノ酸と脂質の代謝が大幅に上昇したことが特徴でした（図1）。 。 さらに、2回目の実験中に高温で熟成させたサンプル(B)は、対照(A)と比較して、アミノ酸および脂質代謝に関連する経路(図2a)および関連遺伝子(図2b)の発現の増加を示しました。同じ成熟時期に。 ガラクトース分解のルロワール経路に関連する遺伝子は、タガトース-6-リン酸経路と比較して過剰発現されていました。 乳糖の分解に関与する酵素（lacZ、EC 3.2.1.23およびlacG、EC 3.2.1.85）、ルロワール経路およびタガトース経路は、製造の初期段階で最大の発現を示し、熟成中に減少しました（補足図2）。 アセトインとジアセチルの生成につながる酵素は、クラスト上で上方制御され、高温で発現が大幅に増加しました（Aと比較したB;補足図3）。 さらに、多くのペプチダーゼ、アミノ酸およびペプチド透過酵素、リパーゼ、およびアミノ酸異化作用と脂肪酸のβ酸化に関与する遺伝子が、高温で熟成されたチーズの中心部で過剰発現されました（図2bおよび補足表4）。 。 最後に、温度が高くなると、ピルビン酸からの脂肪酸生合成に関与する遺伝子の発現が促進されました（図3）。 DESeq 分析により、熟成時間に関係なく、条件 A と B で熟成したチーズコア間で差次的に発現される 651 個の遺伝子が特定されました (P 値 < 0.05) (補足表 4)。 それらの中で、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ジペプチドトランスポーター、アミノ酸透過酵素、アミノ酸異化遺伝子、脂肪酸β酸化および生合成は、Aと比較してサンプルBのコアで過剰発現されました（補足表4）。

メタトランスクリプトームはチーズの芯とクラストの分離を促進します。

PCA は、この研究で実行された最初の実験からのチーズのコアとクラストのサンプルの階層レベル 2 にある豊富な KEGG アノテーションに基づいています。 最初の成分 (水平) は分散の 65.7% を占め、2 番目の成分 (垂直) は 12.2% を占めます。 CO、チーズコアのサンプル。 CR、チーズクラストのサンプル。

温度が高いと、熟成関連遺伝子の発現が促進されます。

炭水化物 (紫)、アミノ酸 (オレンジ)、脂質 (シアン) の代謝に属する KEGG 経路 (上) または遺伝子 (下) の割合のユークリッド距離に基づく、2 番目の実験からのサンプルの平均連鎖クラスタリング。 列バーは次のように色分けされます: t0 では赤、チーズ。 青、標準条件で熟成させたチーズ、緑、高温で熟成させたチーズ。 カラー スケールは、Z スコアとして示される各変数のスケール化された存在量を表し、赤は存在量が高いことを示し、青は存在量が低いことを示します。 サンプル ID の最初の部分は熟成時間を示します (t0、塩漬けおよび乾燥後のチーズから 30 日間の熟成まで)。 CO、コアまたはCR、地殻。 A、標準条件で熟成。 B、温度が高い。

アミノ酸から脂肪酸を生成する経路。

ピルビン酸からの脂肪酸の生合成 (A) および分枝鎖アミノ酸の異化からの脂肪酸の生合成 (B)。 分析されたサンプルで同定された KEGG 遺伝子のみが報告され、その存在量がヒートプロット (C) に示されます。 平均連鎖クラスタリングは、KEGG 遺伝子の割合のスピアマン距離に基づいています。 2 番目の実験のサンプルのみを示します。 列バーは次のように色分けされます: t0 では赤、チーズ。 ブルー、標準的な条件で熟成させたチーズ。 緑色の、高温で熟成させたチーズ。 カラー スケールは、Z スコアとして示される各変数のスケール化された存在量を表し、赤は存在量が高いことを示し、青は存在量が低いことを示します。 サンプル ID の最初の部分は熟成時間を示します (t0、塩漬けおよび乾燥後のチーズから 30 日間の熟成まで)。 CO、コアまたはCR、地殻。 A、標準条件で熟成。 B、温度が高い。 *マロニル-CoA はプロパノイル-CoA で置換され、奇数鎖の脂肪酸が生成されます。 **各サイクルで、2 つの炭素原子が追加されます。

アミノ酸代謝発現は主にファーミクテス門に関連しており、この門の代謝に対する温度の明らかな影響を示唆しています(図4)。 具体的には、Ｌｂ． カゼイは、高温下で著しく増加するようであった。 しかし、他の NSLAB 分類群 (Lb. buchneri、Lb. plantarum、Lb. gasseri、Lb. fermentum、Lb. rhamnosus、Leuconostoc kimchii、Leuc. mesenteroides、Leuc. citreum、Pediococcus pentosaceus など) もアミノ酸代謝活性の増加を示しました。より高い温度。 KEGG 遺伝子、OTU、メタボローム間の有意な (FDR < 0.05) スピアマン相関を示すネットワークは、NSLAB の存在量が、アミノ酸および脂肪酸の代謝、ならびに揮発性化合物、脂肪分解およびメタボロームの存在量と正の相関があることを明確に示唆しています。タンパク質分解指数 (図 5)。 さらに、熟成に関連する活性は、天然スターターからの好熱性 LAB の量と逆相関していました (図 5)。

温度が高いと、NSLAB アミノ酸代謝が促進されます。

2 番目の実験で得た、熟成 30 日目のチーズコアのサンプルにおける KEGG アミノ酸代謝に属する遺伝子の分類学的割り当て。 ファーミキューテス属に属する種のみが報告されています。 A、標準条件で熟成。 B、温度が高い。

NSLAB の存在量、熟成関連遺伝子発現、メタボロームは強く関連しています。

アミノ酸および脂質代謝、VOC、脂肪分解およびタンパク質分解の指標に属する KEGG 遺伝子と、16S rRNA シーケンスによって同定されたファーミクテスに属する OTU との間の有意な (FDR < 0.1) スピアマン相関を示すネットワーク。 ノード サイズは、有意な相関の数に比例するようになりました。 エッジの色は、負の (青) または正の (グレー) 相関を示します。 ノードの色は次のように割り当てられました。緑色、アミノ酸代謝に関連する KEGG 遺伝子。 赤、脂質代謝に関連するKEGG遺伝子。 黄色、VOC。 マゼンタ、化学インデックス。 シアン、ファーミクテス OTU。

熟成温度が高いと、チーズの中心部とクラストの両方でフレーバー化合物の発生も促進されました（表 1）。 メタボローム プロファイルは、メタトランスクリプトーム解析からの発現プロファイルと非常に一致していました。 揮発性短鎖脂肪酸 (ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、デカン酸) が、2-メチル ケトンやヘキサノール、2-ヘプタノール、1-ブタノール、3-ブタノールなどのアルコール化合物とともに、最も多く含まれています。メチルブタノール。 メチルケトン、第二級アルコール、遊離脂肪酸は熟成中に大量に増加し、高温で上昇しました。これは 3-メチルブタノールでも観察されました (P < 0.05)。 遊離脂肪酸は、トリアシルグリセロールの直接脂肪分解から生じることもあれば、アミノ酸異化作用から生じるピルビン酸からエクスノボで合成されることもあります (図 3)。 脂肪分解とタンパク質分解の指数は中心部でより大きく、高温で熟成させたチーズでは増加しました (表 1)。 したがって、pH 4.6 の不溶性窒素画分の LC/MS 分析では、高温で熟成させたチーズ中の αs1- および β- カゼインのいずれかの広範な分解が示されましたが、pH 4.6 可溶性画分は、窒素に由来する大量の可溶性ペプチドを示しました。 2つのタンパク質（補足図4）。

チーズの熟成プロセスは非常に複雑で、微生物学的および生化学的な変化が関与し、特定の風味や食感が生まれます。 チーズのマイクロバイオームは、熟成中に遭遇する非生物的要因 (pH、aw、NaCl 濃度、O2 利用可能性) によって形成されます。 したがって、異なる環境条件により、チーズのコアとクラストでは異なる力学が発生する可能性があります3,19。 表面熟成チーズにおける真菌および細菌に関連する代謝活動の重要性が最近強調されています 16,17,20 が、熟成チーズにおける NSLAB の増加は以前に観察されていました 7,10。 NSLAB はタンパク質分解性として知られており 21、22、23、選択された培養物の添加物はタンパク質分解レベルを上昇させることが示され 8、24、25、これらがチーズの熟成中に重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。 我々は、それらの本質的な寄与の具体的な証拠を提供し、マイクロバイオームの異なる構造と機能がチーズのコアとクラストで進化し、熟成はNSLABの継承によって引き起こされる、コアからクラストに向かう勾配で進行することを示している。 チーズの表面では、aw の低下と O2 濃度の上昇により環境が悪化し、NSLAB の発達が遅れ、細胞の代謝が増殖と炭水化物からのエネルギー生産に向けられます。 一貫して、チーズのクラストでは乳糖の分解とガラクトースの代謝が遅くなり、そのレベルはコアに比べてクラストの方が常に高く保たれていました。 さらに、微生物の活動は熟成中に適用される条件に強く影響されます。 より高いタンパク質分解レベルを細菌の活動と独占的に結び付けることはできず、内因性酵素はカード調理ステップなしでもチーズ中でまだ活性である可能性があります。 しかし、熟成活動に対する細菌の明らかな寄与は、メタトランスクリプトームとメタボロームデータ間の一貫性、およびNSLABの発生、発現プロファイル、代謝パターン間の有意な程度の相関によって裏付けられています（図5）。 特に、熟成に関連する活動の細菌遺伝子発現は、代謝産物プロファイル、タンパク質分解および脂肪分解指数に大きく関連しています。

高温により促進されたタンパク質分解、脂肪分解、およびアミノ酸/脂肪酸の異化作用の増加により、揮発性化合物の生成が確実に促進されました。 観察された遊離脂肪酸は、トリアシルグリセロールの直接脂肪分解、およびアミノ酸異化によって生成されるピルビン酸からのエクスノボ生合成から生じる可能性があります 26。 さらに、3-メチルブタノールはロイシンの分解によって生成され、メチルケトンと第二級アルコールは脂肪酸の異化によって生成されます27,28。

最近、発酵食品（MCoFF）における微生物集合メカニズムを探索することの重要性が強調されています18。 発酵食品は、微生物の代謝パターンと生態学的動態を研究し、主要な要因を特定し、より複雑な環境に簡単に推定できる仮説を検証する興味深い機会を提供します18。 微生物群集の集合と代謝に対する非生物的要因の影響を理解するためにそれらをどのように使用できるかを明確な例で示します。 これは、より複雑な環境における微生物群集の動態をモデル化できる可能性を裏付けています18。

熟成温度の上昇により、タンパク質分解、アミノ酸/脂質の輸送および異化に関連する遺伝子の発現が促進され、遊離アミノ酸および脂肪酸の濃度が高くなり、カチョカヴァロ チーズのボラティロームに通常見られる VOC の生成が促進され、おそらく熟成が加速される可能性があります 7。熟成させ、チーズの潜在的な風味への影響を強化します。 実際、高温でわずか 20 日間熟成させたチーズは、標準温度で長期間熟成させたチーズと非常によく似たトランスクリプトーム プロファイルを示しており、熟成関連の活性が熟成条件の変化によって促進されることを示しています。 最後に、KEGG アミノ酸代謝経路に関連する遺伝子の分類学的割り当てにより、高温によるアミノ酸代謝の変化が確認され、チーズの熟成における基本的な役割を果たしている NSLAB の役割が強調されました。

この結果は、チーズのマイクロバイオームとその活動を操作するために熟成条件の変化がいかに重要であるか、またマイクロバイオームの反応を即座に加工条件と製品品質の改善に利用できることを明確に示しています。

チーズの製造と熟成は、南イタリアにある酪農場で行われ、保護原産地呼称 (PDO、CE Reg. 1263/96) を取得したカチョカヴァッロ シラノ チーズを生産しました。 最初の実験では、生乳および加熱牛乳、NWC、5 時間発酵後、延伸前 (pH が約 5.25 に達したとき) のカード、成型後、塩漬け後および熟成中 (10、20、30、および 60 ℃) のチーズを使用しました。日）を収集し、16S rRNAシーケンスおよびRNA-seqを通じて分析しました（補足表5）。 2 番目の実験では、マイクロバイオームに対する熟成パラメーターの影響を評価するために、同じ製造からのチーズを 3 つの異なる条件で熟成させることにしました。 対照熟成 (A) では、乳製品工場の標準条件 (16°) を使用しました。 C および 75% RH、条件 A)、温度を 20 °C に上げる (B)、または RH を 65% に下げる (C)。 この 2 番目の実験では、最長 30 日間熟成させたチーズを収集しました。 補足表 5、本文および図全体で報告されるサンプル ID は、次のように割り当てられました。ID の最初の部分は、熟成時間を示します (t0、塩漬けおよび乾燥後のチーズから、熟成 60 日まで)。 CO、コアまたはCR、地殻。 A、標準条件での熟成、B、高温での熟成、C、より低い相対湿度での熟成。

水分活性（ａｗ）は、ＨｙｇｒｏＰａｌｍ２３－ＡＷ装置（Ｒｏｔｒｏｎｉｃ ＡＧ、Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ）を使用して測定した。

コア（チーズの中央に集められた内側の部分）とクラスト（外層を剥がした後の外側の部分）からのサンプルを無菌条件で（厚さ約0.5 cmのスライスに）切断し、別々に分析しました。 さまざまな分析のために、各サンプルからさまざまなアリコートを滅菌ビニール袋に収集し、冷蔵条件 (4 °C) で研究室に輸送しました。 RNAlater (Ambion、カリフォルニア州フォスターシティ) を、輸送前の RNA 抽出に使用するアリコートに 1:6 の比率で添加しました。 微生物数の計測を除き、サンプルは分析前に -80 °C で保存されました。微生物数の計測は以下のようにサンプリングから 2 時間以内に行われました。

各サンプリング時および各熟成条件下で、サンプル 25 グラム (固体) または 25 ml (液体) を、ストマッカー内で 225 ml の 4 分の 1 強度のリンガー液 (Oxoid、ミラノ、イタリア) 中で 2 分間均質化しました ( ＬＡＢ Ｂｌｅｎｄｅｒ ４００）を、室温でＳｔｏ－Ｃｉｒｃｕｌ－Ｂａｇストマッカーバッグ（両方ともＰＢＩ、ミラノ、イタリア）を使用して行った。 4分の1強度のリンゲル液で10進希釈液を調製し、適切な希釈液の1 mlアリコートをM17またはMRS寒天培地（Oxoid、ミラノ、イタリア）に三重に接種し、それぞれ好気性および嫌気性で30または42℃で48分間インキュベートしました。 h 中温性および好熱性の連鎖球菌または乳酸菌の生菌数を取得します。 結果は、3 つの独立した測定の対数コロニー形成単位 (CFU)/g の平均として計算されました。

後で RNA に保存したサンプルをホモジナイズし、混合物 10 ml を 4 °C で 10 分間遠心分離しました (12,000 × g)。 2 つの生物学的複製 (各サンプリングポイントおよび各条件の 2 つの異なるチーズ) を RNA 抽出に供し、さらなる処理の前に全 RNA をプールしました。 ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、ＰｏｗｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ＭｏＢｉｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してＲＮＡ抽出を２回行った。 TURBO-DNase (Ambion、カリフォルニア州フォスターシティ) による 37 °C で 3 時間の処理により DNA を除去しました。 DNAが存在しないことをPCRによってチェックし、必要に応じて処理を繰り返した。 RNA の品質は、アガロースゲル電気泳動および 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies、カリフォルニア州パロアルト) によってチェックされました。 定量化には、Qubit および Qubit RNA Assay キット (Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド) を使用しました。

相補的 DNA (cDNA) は、High-Capacity cDNA Reverse Transcription キット (Applied Biosystems, Carlsbad, California) を使用して、200 ng の全 RNA から合成しました。 微生物の多様性は、他の場所で報告されているように、16S rRNA の増幅された V1 ～ V3 領域のパイロシーケンスによって研究されました 29。 PCR 条件、ライブラリーの調製、および配列決定は、最近記載されているように実行されました 30。

最初の実験のすべてのサンプルと 2 番目の実験の選択されたサンプルについてメタトランスクリプトームが研究されました (補足表 3)。 すべてのサンプルについて 2 つの複製を配列決定しました (各複製は、2 つの異なるチーズから抽出された RNA をプールすることによって得られました)。 Ribo-Zero Magnetic キット (ノースカロライナ州シャーロットの Epicentre) を使用してリボソーム RNA (rRNA) を除去し、メーカーの指示に従って Agencourt RNAClean XP (イタリア、ミラノ、Beckman Coulter) で mRNA が濃縮された RNA を精製しました。 次に、ScriptSeq v2 RNA-Seq Library Preparation Kit (Epicentre、Charlotte、North Carolina) (インサート サイズ約 300 bp) を使用して、ライブラリーの調製とサンプルの多重化を実行しました。 ライブラリの品質は、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies、カリフォルニア州パロアルト) によってチェックされました。 シーケンスは、Mid Output Kit を備えた Next Seq 500 Sequencer (どちらも Illumina、San Diego、California 製) で実行され、150 bp のシングルエンド読み取りが得られました。

以前に報告された 30 ように、16S rRNA アンプリコンのリードは QIIME 1.9.0 ソフトウェア 31 を使用して分析されました。 uclust パイプライン 32 を使用して 99% の類似性で定義された OTU が選択され、代表的な配列が RDPII 分類器 33 に送信され、Greengenes 16S rRNA 遺伝子データベース 34 を使用して各 OTU の分類割り当てと相対存在量が取得されました。

全体のメタトランスクリプトーム データ分析は次のように実行されました。生のリード品質 (Phred スコア) は、FastQC ツールキット (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を使用して評価されました。 CutAdapt35 を使用すると、アダプターとプライマーのコンタミネーションが除去されました。 次に、SolexaQA++ ソフトウェア 36 を使用して、低品質の塩基 (Phred スコア <20) をトリミングし、60 bp より短いリードを廃棄しました。 読み取りは、Bowtie237 をエンドツーエンドの機密モードで使用することにより、参照データベースに合わせて調整されました。 使用したデータベースは、NCBI RefSeq データベース (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ASSEMBLY_BACTERIA/) および http://patricbrc からゲノムのタンパク質コード部分 (.ffn ファイル) をダウンロードして構築されました。 .org/ポータル/。 含まれる種は、16S シーケンスの結果と、食品生態系で一般的に見られる種の選択に従って選択されました (補足表 6 にリストされています)。 私たちはメタゲノミクスを実施しておらず、それらのサンプルから直接単離された株のゲノムを持っていなかったので、配列決定された利用可能なゲノムがすべて含まれていました。 連結された .ffn ファイルは、機能注釈と遺伝子分類を取得するために、mblastx39 を使用して、京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) データベース 38 バージョン 2011 年 4 月と照合されました。 データベース内の各遺伝子に一意にマッピングされたリード数は、SAMtools40 を使用して抽出され、R 環境 (www.r-project.org) で構築されたカスタム スクリプトを使用してライブラリ サイズに従って正規化されました。 少なくとも 5 リード/サンプルがマッピングされた遺伝子のみが、その後の分析のために保存されました。 統計解析とプロットは R 環境で実行されました。 差次的遺伝子発現解析は、Bioconductor パッケージ DESeq41 を使用して実行されました。 P 値は、Benjamini-Hochberg 手順 42 を使用した複数の検定用に調整され、誤検出率 (FDR) < 0.05 が有意とみなされます。 OTU、KEGG 遺伝子、揮発性有機化合物、生化学指標間のペアワイズ スピアマン相関は、R パッケージ psych を使用して計算され、有意なもの (FDR < 0.05) は Cytoscape v. 2.8.143 を使用して相関ネットワークにプロットされました。 主成分分析 (PCA) と階層的クラスタリングは、R の made4 パッケージを使用して実行されました。すべての結果は、2 回の反復の平均値として報告されます。

揮発性化合物の抽出は、Lee et al.44 に従って実行されました。 冷凍チーズを細かくすりおろし、２５ｇを１００ｍＬボトルに移し、２５ｍＬの脱イオン水、５０μＬの２－メチル－３－ヘプテノン（純度９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を内添剤として加えた。標準 (950 mg L-1) および 12.5 g のリン酸ナトリウム (NaH2PO4)。 ボトルをウォーターバス中で 50 °C に 10 分間保ち、チーズを溶かしました。 次に、溶けたチーズを 50 °C で 20 分間磁気撹拌して、ヘッドスペース内の揮発性化合物の平衡を促進しました。 SPME ファイバー (厚さ 50/30 μm のジビニルベンゼン/カルボキセン/ポリジメチルシロキサン、2 cm、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州) をボトル内のテフロン隔膜を通して挿入し、40 °で 30 分間サンプルのヘッドスペースに曝露しました。撹拌中はC。 同じ種類の繊維がチーズの香り分析に非常に効率的であることが報告されています45。 揮発性化合物は、J&W HP-5MS キャピラリー カラム (30 m × 0,25 mm id × 0、膜厚２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州フォルサム）。 温度を40℃に2分間設定し、40℃から160℃まで6℃/分の速度で上昇させ、160℃から210℃まで10℃/分で上昇させました。 インジェクターは 250 °C に保たれました。 ヘリウムをキャリアガスとして使用しました（0.9 mL min-1）。 質量スペクトルは 70 eV で記録されました。 ソース温度は 230 °C、界面温度は 250 °C でした。 揮発性化合物の熱脱離は、SPME ファイバーをインジェクター内で 10 分間暴露することによって実行されました。 化合物の同定は、保持時間および質量スペクトルを、同じ条件の純粋な参照化合物のそれらおよび NIST データベースのそれらと比較することによって実行されました。 使用前に、ファイバーを 270 °C で 1 時間コンディショニングしました。 望ましくない化合物の放出を防ぐために、各分析の前にブランクテストを実行しました。 定量分析は、各化合物のピーク面積を内部標準のピーク面積に対して正規化することによって実施した。 ピーク領域は、ソフトウェア Chemstation (Agilent Technologies、カリフォルニア州パロアルト) によって処理されました。 分析は 3 回繰り返して実行されました。

異なるサンプル間の有意差は、一元配置 ANOVA 統計分析によって各化合物について決定されました。 Tukey の検定は、変数の平均値を区別するために使用されました。 P < 0.05 の差は有意であるとみなされました。 データの作成は、Microsoft Excel (Addinsoft Corp.、パリ、フランス) のアドイン ソフトウェア パッケージである XLStat (バージョン 2009.03.02) を使用して実行されました。

粉チーズ (5 g) を 100 mL の 0.4 M クエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 8.0) に分散させ、あらかじめ 40 °C に加熱し、Ultra-Turrax 装置 (Ultra-Turrax モデル T25、Ika Labortechnik、シュタウフェン、ドイツ) で 1 分間均質化しました。 ）。 加水分解度 (DH) は、Hermanson による 2,4,6-トリニトロベンゼン スルホン酸法 46 に Picariello ら 47 が報告した修正を加えて測定しました。 LC-MS分析のために、クエン酸可溶性画分のpHを4.6に調整した。 得られた懸濁液を３０００ｇで１０分間遠心分離し、脂肪層を除去し、不溶性画分と可溶性画分を分離した。 次に、以前に報告されているように、ESI 源を備え、陽イオンモードで動作する Q TOF Ultima ハイブリッド質量分析計 (Waters、マンチェスター、英国) を使用して、2 つの画分を LC/ESI-Q/TOF MS/MS によって分析しました 48。

脂肪分解指数は、サンプル 1 g に含まれる遊離脂肪酸を中和するのに必要な KOH の量 (mg) として表されました。 脂肪を抽出するために、各冷凍サンプル 20 グラムを細かくすりおろし、3 グラムのおろしチーズを 50 ml のエタノール/ジエチルエーテル (1:1 v/v) と撹拌しながら 30 分間インキュベートしました。 懸濁液をワトマン紙番号４２を通して濾過し、濾液の酸性度をＤｕｇａｔ－Ｂｏｎｙらによって記載されているように滴定によって測定した１６。 各サンプルを 3 回分析しました。

16S rRNA およびメタトランスクリプトームの配列は、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) のシーケンス リード アーカイブ (SRA) で、それぞれアクセッション番号 SRP061555 および SRP061556 で入手できます。

この記事を引用する方法: De Filippis, F. et al. メタトランスクリプトミクスは、チーズの熟成速度に影響を与えるマイクロバイオームの温度による機能変化を明らかにします。 科学。 議員6、21871; 土井: 10.1038/srep21871 (2016)。

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FDF は、プログラム「POR CAMPANIA FSE 2007/2013」 - プロジェクト CARINA (カンパニアにおける農産物生産の安全性の持続可能性と競争力) - CUP B25B09000080007 内のカンパニア州からの助成金によって支援されました。 この研究にサンプルを提供していただいたイタリア、モンテサーノ スッラ マルチェラーナの酪農場 Campolongo Srl に感謝いたします。

ナポリ大学フェデリコ 2 世農学部、Via Università 100、ポルティチ、80055、イタリア

フランチェスカ・デ・フィリッピス、アレッサンドロ・ジェノヴェーゼ、パスカーレ・フェランティ、ダニーロ・エルコリーニ

バイオサイエンス部門 (BIO)、アルゴンヌ国立研究所、アルゴンヌ、イリノイ州、米国

ジャック・A・ギルバート

シカゴ大学生態進化学部、シカゴ、イリノイ州、米国

ジャック・A・ギルバート

シカゴ大学外科（米国イリノイ州シカゴ）

ジャック・A・ギルバート

シカゴ大学ゲノム・システム生物学研究所、シカゴ、イリノイ州、米国

ジャック・A・ギルバート

米国マサチューセッツ州ウッズホールの海洋生物学研究所

ジャック・A・ギルバート

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FDF は 16S およびメタトランスクリプトミクス実験とデータ分析を実行し、原稿を執筆しました。 DE は研究を設計し、原稿の準備に貢献しました。 JAG はデータ分析と原稿作成に貢献しました。 AGとPFはメタボロームの解析を行った。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

De Filippis、F.、Genovese、A.、Ferranti、P. 他メタトランスクリプトミクスは、チーズの熟成速度に影響を与えるマイクロバイオームの温度による機能変化を明らかにします。 Sci Rep 6、21871 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep21871

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受信日: 2015 年 10 月 22 日

受理日: 2016 年 2 月 2 日

公開日: 2016 年 2 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21871

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