試験成績データは牛 DIVA 皮膚試験試薬 (DST) の有用性を示しています

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12052 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ウシ型結核菌 (M. bovis) の弱毒株であるカルメットゲラン桿菌 (BCG) は、牛におけるウシ結核 (TB) を制御するための有力なワクチン候補です。しかし、BCG ワクチン接種はウシのツベルクリンに対する感受性を高めるため、現在のウシ結核監視検査の使用が危うくなります。これに対処するために、当社は BCG ワクチン接種の影響を受けず、BCG ワクチン接種を受けた動物がウシ型結核菌に曝露されてその後ウシ結核を発症するかどうかを検出できる診断用皮膚検査を開発しました。「社内」で配合されたタンパク質カクテル試薬を使用した以前の研究に基づいて、本明細書では、「すぐに使用できる」として配合されたマイコバクテリア抗原 ESAT-6、CFP-10、および Rv3615c を含む単一融合タンパク質 (DST-F) の試験性能データを提示します。市販メーカーの試薬です。我々の結果は、ツベルクリン試薬とは異なり、DST-F を使用した皮膚診断検査が BCG ワクチン接種動物において高い特異性を維持したことを示しています。さらに、DST-F 皮膚検査は、実験的に M. bovis に曝露した後、BCG ワクチン接種によってウシの結核病変を予防できなかった動物を含め、M. bovis 感染動物の特定において高い相対感度を示しました。 DST-F は現在、ライセンス取得と商品化をサポートするために英国で実地試験が行われています。

牛結核 (TB) は、世界中の重要な家畜種に影響を及ぼす病気です。この病気はマイコバクテリウムの結核菌グループの病原体によって引き起こされますが、多くの国（英国を含む）では、ウシ結核はほぼ独占的にウシ型結核菌によって引き起こされます。ウシ結核は、生産性の低下と防除プログラムの費用の両方を通じて重要な経済損失の原因となっており、世界的な経済損失は年間約 30 億米ドルと推定されています1。さらに、牛結核は、特に家畜からの牛乳の低温殺菌が保証できない低中所得国において、重大な人獣共通感染症の影響を及ぼします2。

英国では、多くの高所得国と同様に、子宮頸部ツベルクリン単回皮内比較（SICCT）検査に基づく検査と屠殺戦略が採用されており、場合によっては、子宮頸部ツベルクリンリン分泌量を最大化するための補助検査としてインターフェロン-ガンマ放出アッセイが適用されます。感染した動物の検出。しかし、この制御戦略は、英国だけで牛結核に取り組むだけで納税者に年間約 7,000 万ポンド、農家に 5,000 万ポンドの追加費用がかかると推定されている財政的にも、また、約 38,000 頭の牛が飼育されている倫理的にも、コストが高くつきます。この病気に対処するために、2020年7月から2021年6月の間に英国で屠殺された。したがって、ウシ結核に対するウシワクチンの開発は研究の優先順位が高い。

現在までのところ、ウシ結核に対して利用可能な唯一のワクチンは、ウシ型結核菌の弱毒株であるカルメットゲラン桿菌（BCG）であり、ウシにおける実験的ウシ型結核菌感染に対するBCGワクチン接種の効果を評価する有効性研究では、有望な結果が示されている4,5。。さらに、BCG ワクチン接種の有効性は実地研究でも実証されています 6,7,8,9。しかし、研究ではBCGワクチン接種がウシ結核疾患の重症度を軽減することが実証されていますが、すべてのワクチン接種において完全に予防できるわけではないことも強調しています10、11、12、13、14、15。したがって、ウシ型結核菌への曝露後にウシ結核を発症したBCGワクチン接種動物を検出するには、依然として診断検査が必要である。残念ながら、BCG ワクチン接種は現在の皮膚診断用試薬 (すなわち、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体) に対して牛を感作させてしまうため、この状況での使用は不可能になります 16。したがって、BCG ワクチン接種環境における検査および屠殺に基づく管理戦略の継続を確実にするために、研究努力は次のような診断用皮膚検査の開発に焦点を当ててきました。(i) BCG ワクチン接種動物において偽陽性の皮膚検査反応を誘発しない。 (ii) ウシ型結核菌への曝露後にウシ結核を発症する、BCG ワクチン接種を受けた動物を検出することができる。このいわゆる「DIVA 皮膚テスト」 (DIVA: ワクチン接種された動物の間で感染者を検出する) の初期開発は、組換え抗酸菌タンパク質のカクテルの評価に基づいており 17、タンパク質 ESAT-6、CFP-10、および Rv3615c18 を優先する結果となりましたが、さらなる改良では、これらを「社内」で配合された単一融合タンパク質試薬として使用する19。これらの研究を拡張するために、当社は商業メーカーと緊密に協力して「すぐに使用できる」DIVA 皮膚検査融合タンパク質試薬 (DST-F) を製造しました。この試薬の性能データはここに示されています。

感染牛を識別する DST-F の能力を評価するために、一連の実験的な M. bovis 感染研究 (表 1; 研究 1 ～ 3) が実施されました。ウシ結核病理の死後検査と死後組織サンプルの培養により、研究した 71 頭すべての動物で M. bovis 感染が確認されました (データは示されていません)。合計で、これらの動物のうち 68 匹が DST-F 検査で陽性反応を示しました (表 2)。これは SICCT 検査で観察されたもの (62 匹の検査陽性) よりも多く、SIT 検査で観察されたもの (70 匹の検査陽性) よりわずかに少ないだけでした。。これにより、ウシ型結核菌に感染した動物における DST-F の有望な性能データが得られましたが、この試験の真の対象動物グループは、ウシ結核の発症を完全に防御できていない BCG ワクチン接種を受けた牛です。したがって、ウシ型結核菌への実験的曝露後にウシ結核の兆候を示したBCGワクチン接種牛を識別するDST-Fの能力を評価するために、3つの別々のワクチン/攻撃実験を実施しました（研究4～6）。繰り返しますが、各実験の終了時に、すべての動物は詳細な死後検査を受け、ウシ結核病理の兆候が記録され、リンパ節と肺組織のサンプルがウシ型結核菌の培養のために収集されました。これらの調査結果を図 1 にまとめます。3 回の実験すべてにおいて、リンパ節組織の目に見える病変のレベルは、その実験における感染のみの対照群と比較して、ワクチン接種/感染群の動物で有意に低かったです。同様に、3 回の実験のうち 2 回では、目に見える病変スコアの合計もこのグループの動物で有意に低かった。したがって、3 つの実験すべてで、ウシ型結核菌による実験的感染後のウシ結核病状の重症度に対する BCG ワクチン接種の保護効果が実証されました。しかし、これらの結果は、BCG はウシ結核病状の重症度を制限するものの、BCG ワクチン接種を受けた 73 頭/M 頭のうち 1 頭以外全員の死後組織から M. bovis が培養できるため、BCG がウシ結核感染そのものを予防するわけではないことも示した。。ウシ感染動物（データは示されていない）。したがって、我々は、BCGワクチン接種が確認された72の培養物/Mを検出するDST-F試薬の能力を評価した。ウシ感染動物。これら 72 匹の動物のうち、65 匹が DST-F 試薬に対して陽性反応を示しました (表 2)。これは SICCT 検査で観察された動物 (61 匹の検査陽性) よりも多かったものの、SIT 検査で観察された動物 (72 匹の検査陽性) よりは少なかったです。ワクチン未接種の方へ/M. これらの研究で得られたウシ感染対照動物は、すべてウシ型結核菌感染の証拠を示し、研究 6 の 1 頭の動物を除いて、DST-F 試薬に対して陽性反応を示しました。これらのグループのすべての動物は、SICCT および SIT 検査でも陽性でした。

BCGワクチン接種によるウシ結核の目に見える病理の減少。 BCGワクチン接種済み/Mのリンパ節、肺、および総病理スコア。ウシ感染者（Vac/Inf）とワクチン接種を受けていない/M. 研究 4 (A)、研究 5 (B)、および研究 6 (C) からのウシ感染対照 (Inf)。各記号は個々の動物を表し、水平バーはグループの中央値を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01、マン・ホイットニー検定。

DST-F によって引き起こされる偽陽性結果のレベルを評価するために、非感染動物の 3 つのグループで皮膚検査を実施しました (研究 7 ～ 9)。結果を表 2 にまとめます。非感染対照動物では、DST-F 試薬またはツベルクリン試薬に対する偽陽性反応は観察されませんでした。同様に、BCG ワクチン接種を受けた 20 頭の子牛では、DST-F に対する偽陽性反応は観察されませんでした (研究 9)。対照的に、ツベルクリン試薬で検査されたBCGワクチン接種子牛の高い割合が偽陽性反応を示し、SICCT検査とSIT検査ではそれぞれ7/10と10/10が陽性でした。

これら 9 つの研究から生成された皮膚検査データを組み合わせて、表 3 にまとめます。ウシ型結核菌感染動物の検出における DST-F の相対感度は 95% であり、SICCT 検査 (89%) よりも高かったただし、SIT テスト (99%) よりも低いです。ただし、これらの違いはいずれも統計的有意性を達成しませんでした。実験的なウシ型結核菌感染後にウシ結核の兆候を示した BCG ワクチン接種動物の検出における DST-F の相対感度は、90% とわずかに低くなりました。この場合も、SICCT 検査の値 (85%) よりは高かったが、SIT 検査の値 (100%) よりは有意に (p < 0.05、マクネマーの検定) 低かった。 3 つの皮膚検査のいずれも、非感染対照動物では偽陽性反応を誘発せず、特異性推定値は 100% となりました。同様に、BCG ワクチン接種動物では DST-F に対する偽陽性反応は観察されず、やはり特異性推定値は 100% となりました。対照的に、このグループの動物では、SICCT (p < 0.05、マクネマー検定) および SIT (p < 0.01、マクネマー検定) 検定の有意に低い値が観察され、特異性推定値はそれぞれ 30% および 0% でした。

当社の DIVA 皮膚検査試薬の最初の開発は、ウシ型結核菌に感染した牛では免疫原性を示したが、ナイーブまたは BCG ワクチン接種した動物では反応を誘導しなかった組換え抗酸菌タンパク質のカクテルと、ESAT-6、CFP-10 からなるカクテルに基づいていました。そして、Rv3615c タンパク質は、さまざまな牛グループでの評価に優先されました。これらの分析の結果は、標準的な解釈で評価した場合、ツベルクリン SICCT 検査と同様の感染検出の相対感度を維持しながら、BCG ワクチン接種動物または非感染対照で試験した場合、この試薬の高い特異性を実証しました 18。ただし、製造の観点から見ると、単一の融合タンパク質試薬の製造には、3 つの個別のタンパク質のカクテルからなる試薬よりも多くの利点があります。たとえば、カクテルの成分には 3 回の別々の生産実行が必要であるのに対し、融合タンパク質には 1 回の生産実行のみが必要です。さらに、カクテル試薬の製造と比較して、単一の融合タンパク質の製造では、必要な関連品質管理データが 3 分の 1 削減されます。最後に、個別に製造された 3 つの成分からカクテル試薬を調合するためのシステムを導入する必要はありません。概念実証データでは、ESAT-6、CFP-10、および Rv3615c の融合タンパク質が、ウシ型結核菌に感染したウシの末梢血単核球を使用して in vitro IFN-γ 産生を誘導するが、ナイーブ対照または BCG ワクチン接種した動物からは誘導しないことが実証されました 19。さらに、この融合タンパク質は、皮膚検査試薬として「社内」で配合された場合、ウシ型結核菌に感染した動物では陽性の皮膚反応を引き起こしましたが、ナイーブコントロールでは反応を引き起こしませんでした19。この試薬を潜在的な商品にさらに開発するために、当社は製造業者 (すなわち、Lionex) と協力して、「ボトルからそのまま」使用できる融合タンパク質 DIVA 皮膚検査試薬 (DST-F と呼ばれる) を製造しました。ツベルクリン試薬と同様の方法です。さらに、品質管理プロトコルとバッチリリース基準（材料と方法を参照）は、適正製造基準に沿った商業生産へのスケールアップの可能性を念頭に置き、バッチ間の一貫性を保証するために開発されました。合計で、カクテルおよび融合タンパク質製剤に基づく DIVA 皮膚検査試薬は、191 頭の動物で「直接」検査されました (未発表データ)。 2 つの試薬の試験結果を評価する統計分析では、コーエンのカッパ係数 0.885 (95% CI 0.819 ～ 0.951) と 94% の一致が観察され、2 つの試薬間の「ほぼ完全な一致」20 が示されました (データは示されていません)。）。したがって、融合タンパク質の製造上の利点を考慮して、DST-F 試薬が今後の DIVA 皮膚検査試薬の候補として選択されました。

表 3 にまとめたように、実験的に確認されたウシ型結核菌感染動物の同定における DST-F の相対感度は 95% (95% CI 88% ～ 98%) であり、これは、米国で実施された SICCT 検査の感度よりも高かった。これらの動物でも同時に。ただし、この相対感度推定値は実験的に感染させた動物を使用して生成されたものであり、自然感染牛で使用した場合には DST-F 検査の性能を完全に表していない可能性があることに注意してください。実際、DIVA 皮膚検査カクテル製剤に関する以前に発表されたデータは、実験的に感染した動物と比較して、自然に感染した動物における検査陽性の割合が有意に低いことを示しました (それぞれ 78 および 100%; p < 0.05、フィッシャーの直接確率検定)。標準的なSICCT検査で陽性反応を示した自然感染動物の割合も約76%であった18。さらに、「社内」融合タンパク質製剤の最初の概念実証データでも同様の結果が実証され、実験的に感染させた動物の 100% (6 頭中 6 頭) と比較して、自然に感染した動物の 76% (21 頭中 16 頭) で同様の結果が得られました。皮膚検査で陽性結果が出た（データは示されていない）。したがって、我々の現在の研究の焦点の1つは、自然感染牛の増加数におけるDST-Fのパフォーマンスをさらに評価し、将来のDST-F検査をサポートする現実的なシナリオでDST-F検査感度の統計的に堅牢な正確な計算を提供することです。検証演習。

過去 25 年間にわたる数多くのワクチン接種/攻撃研究により、BCG ワクチン接種がウシ結核疾患の重症度を軽減することが実証されています4。しかし、BCGワクチン接種を受けた動物でも（重症度は低いとはいえ）ウシ結核を発症する可能性があることを考えると、これらの動物を検出する診断薬の能力を理解することが重要です。この目的を達成するために、我々は 3 回の BCG ワクチン接種 / ウシ型結核菌感染実験を実施し、ウシ型結核菌に曝露された後にウシ結核疾患の証拠を示した動物を検出する際の DST-F の相対感度を評価しました。これらの研究の結果は、90% という高い相対感度 (95% CI 81% ～ 95%) を示し、ワクチン接種を受けていない M で推定された値と有意な差はありませんでした (p = 0.348、フィッシャーの直接確率検定)。ウシ感染動物（表 3）。ワクチン接種を受けていない動物と比較して、BCG ワクチン接種を受けた牛では、結核病変の数、結核病変の重症度、罹患組織から回収された生菌数の減少が示されました11、15、21、22、23。したがって、この疾患負担の軽減により、マイコバクテリア抗原に対するエフェクター免疫応答の進行中の活性化が低下し、結果としてこれらの応答を読み取り値として利用する診断検査の感度が低下する可能性があることが予想される。そのことを念頭に置くと、対象動物グループ、つまりウシ型結核菌への曝露後にウシ結核の証拠を示した BCG ワクチン接種動物において DST-F の相対感受性が高いままであることは心強いことである。

特異性データを生成するために、DST-F 試薬を 2 つの動物グループ (i) 非感染子牛と (ii) BCG ワクチン接種子牛でテストしました。表 3 に示すように、これらの研究の結果は、DIVA 皮膚テストカクテルに関する以前に公表されたデータ 18 と一致しており、DST-F 試薬が実験条件下で BCG ワクチン接種と互換性のある DIVA テストに必要な高レベルの特異性を維持していることが確認されました。これをさらに安心させるために、現在、フィールド試験で DST-F 特異性のさらなる評価が計画されています (下記を参照)。

ここに提示された DST-F 性能データは、DST-F の実地試験の開始を可能にするための動物検査証明書 (ATC) を英国獣医薬総局に申請するための一部を形成しました。この申請書には、製造プロセスの概要 (ライオネックス提供) と、動植物衛生庁 (APHA) が適正検査基準に基づいて実施した安全性研究の結果も含まれており、DST-F の単回および反復投与は未治療の子牛とBCGワクチン接種を受けた子牛の両方で、注射部位と一般的な健康パラメータ（体温、臨床観察、一般的な行動を含む）をモニタリングすることによって評価されました。この研究の結論は、DST-F の皮内投与を単独で、またはツベルクリン皮膚検査試薬の投与と同時に投与しても、未処置または BCG ワクチン接種を受けた子牛において局所的または全身的な悪影響を引き起こさないということでした（データは示さず）。 ATCは無事に授与され、英国では現在、多数のBCGでの野外評価を続ける前に、ワクチン接種を受けていない多数の牛を野外で使用してDST-F試薬の安全性と特異性を最初に確認するための野外試験が進行中である。これらの研究から生成されたデータが将来の DST-F 試薬の販売承認をサポートすることを目的として、ワクチン接種を受けた牛。

合計 3 つの研究が実施されました (表 1; 研究 1 ～ 3)。いずれの場合も、雄の子牛（生後6～12か月）は、最近のウシ結核の病歴がなく、公式にウシ結核のない英国の牛群から調達され、実験中はAPHAウェイブリッジで飼育された。感染後約 5 ～ 6 週間後に皮膚検査を実施しました。動物の詳細を表 1 にまとめます。

合計 3 つの研究が実施されました (表 1; 研究 4 ～ 6)。 APHA ウェイブリッジで行われた 2 つの実験 (研究 4 および 5) では、雄の子牛 (生後 4 か月から 8 か月) は、最近のウシ結核の病歴がなく、APHA ウェイブリッジで飼育されていた英国の正式にウシ結核のない牛群から供給されました。実験中ずっと。 AgResearch が実施した実験 (研究 6) では、飼育動物および野生動物が結核に感染していないニュージーランドの地域から、結核のない認定を受けた牛群から雌牛 (約 12 か月齢) を入手しました。動物はAgResearch Aorangi農場で飼育され、ワクチン接種を受けましたが、ウシ型結核菌による攻撃の直前に牛はAgResearch Kaitoke農場の結核封じ込めユニットに輸送されました。感染後 8 ～ 14 週間の間に皮膚検査を実施しました。動物の詳細を表 1 にまとめます。

合計 2 つの研究が実施されました (表 1; 研究 7 および 8)。研究 7 では、雄の子牛 (生後 8 ～ 12 か月) は、最近のウシ結核の病歴がなく、英国で正式にウシ結核のない牛群から調達され、実験中 APHA ウェイブリッジで飼育されました。研究 8 では、子牛 (生後 40 ～ 54 日) が適正検査基準 (GLP) の品質基準に従って実施された DST-F 安全性研究に登録され、獣医薬総局 (ウェイブリッジ、英国) への動物実験証明書申請をサポートするデータが生成されました。）。これらの子牛には結核がないことを証明することが規制当局から必須の要件があったため、子牛は結核のないことが知られているデンマークから調達されました。動物の詳細を表 1 にまとめます。

上記と同様に、子牛 (生後 43 ～ 57 日) も、BCG ワクチン接種を受けた子牛を対象とした DST-F 安全性研究に登録されました。 BCGワクチン接種の7週間後に皮膚検査を実施しました。動物の詳細を表 1 (研究 9) にまとめます。

生きた動物を含むすべての実験は、関連するガイドラインと規制に従って、ARRIVE ガイドラインに従って実行されました。動物の手順と実験プロトコールは、指定された施設委員会によって承認されました。APHA で行われた作業の場合、これは APHA 動物福祉および倫理審査委員会でした (参考文献 70/7737–2-007、PF7D840A5-2-004v、70/7737–1-) 012 および PFFFE51F-2–002）、一方、AgResearch で行われた作業については、これは草原動物倫理委員会でした（参照 AE 14,741）。

BCG デンマーク株 1331 (AJVaccines、コペンハーゲン、デンマーク) をすべてのワクチン接種に使用しました。全てのBCG接種材料は、BCGの各バイアルを1mlのSauton希釈剤で再構成することによりワクチン接種日に調製し、0.5mlを動物の皮下に投与した。使用した接種材料は、段階希釈物を平板培養することによって滴定され、実際に送達される用量を計算した(表 1)。ワクチン/攻撃実験では、ワクチン接種されていない対照動物にはBCGワクチンを投与しないか(研究6)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の0.5ml皮下注射を投与しました(研究4および5)。

研究 1 ～ 6 の動物は、気管内/気管支内経路を介して M. bovis の毒性株を実験的に感染させました (研究 1 ～ 5 では AF2122/97、研究 6 では 83/6235)。簡単に説明すると、研究 1 ～ 5 では、鼻腔から気管に内視鏡を挿入する前に、子牛を 2% Rompun (0.12 ml/50 kg、静脈内投与、同用量のアンチセダンで逆転、静脈内投与) で鎮静させました。左右の葉の間の主分岐点の直下に内径1.8 mmのカニューレを通して接種材料(2 ml)を送達する。２ｍｌのＰＢＳを使用して、カニューレから接種材料の残りを洗い流し、その後、カニューレおよび内視鏡を引き抜き、カニューレを廃棄した。次の動物に感染させる前に、カニューレを内視鏡に挿入する管を２０ｍｌの滅菌水ですすぎ、内視鏡の外側を滅菌ワイプで拭いた。研究 6 では、子牛を前述のように感染させました 21。牛の感染に使用した接種材料中のウシ型結核菌を培養して CFU を測定しました。ワクチン/攻撃実験 (研究 4 ～ 6) では、動物はワクチン接種後約 8 ～ 10 週間で感染しました。攻撃投与量と攻撃時間の詳細を表 1 にまとめます。

実験終了時に感染動物の死後検査（PME）を実施し、以前に発表されたスコアリングシステムの改良版を使用して肺およびリンパ節で観察された結核病理のレベルを定量化した24。研究の大部分では、次のリンパ節が検査されました。左右の内側咽頭後部。頭蓋縦隔。尾縦隔。左右の気管支。そして頭蓋気管気管支。例外は研究 4 と 5 で、ロジスティック上および実際的な理由により、頭部リンパ節 (顎下および内側咽頭後) は検査されませんでした。各リンパ節を厚さ 1 mm の切片に連続的にスライスし、以下の基準を使用して観察された病変の数と程度に基づいて病理スコアを適用しました。目に見える病変がない場合はスコア 0。単一の小さな病変（直径 1 ～ 2 mm）の場合はスコア 1、2 ～ 5 つの小さな病変または単一の大きな領域（少なくとも 5 mm x 5 mm）の場合はスコア 2。 5 ～ 20 個の小さな病変、または 2 ～ 3 個の大きな領域については 3 をスコアします。 20 を超える小さな病変または 3 を超える大きな領域については 4 をスコアします。リンパ節の 50% 以上の統合病変についてはスコア 5。さらに、肺の各葉を 5 ～ 10 mm の切片に連続的にスライスし、次の方法でスコア付けしました。目に見える病変がない場合はスコア 0。単一の小さな病変（直径 10 mm 未満）の場合はスコア 1。 2 ～ 5 個の小さな病変については 2 をスコアします。 5 ～ 20 個の小さな病変、または単一の大きな領域（直径 > 10 mm）の場合は 3 をスコアします。 20 を超える小さな病変または 1 つを超える大きな領域については 4 をスコアします。病変を含む肺の実質的な患部についてはスコア 5。リンパ節および肺組織のサンプルも、M. bovis 培養のために死後に収集されました。

PME で収集された組織は、処理前に -80 °C で凍結保存されました。簡単に説明すると、個々のサンプルを解凍し、Seward Stomacher Paddle Blender を使用して 10 ml の PBS 中で均質化し、改変 7H11 寒天プレート上に広げました 16。プレート上の個々のコロニーを計数する前に、プレートを 37 °C で少なくとも 4 週間インキュベートしました。

M. avium (PPD-A; 25,000 IU/ml) および M. bovis (PPD-B; 30,000 IU/ml) からの精製タンパク質誘導体を商業メーカー (Thermo Fisher, UK) から入手しました。 PBS中のESAT-6、CFP-10およびRv3615cのヒスチジンタグ付き融合組換えタンパク質からなるDST-F試薬は、商業製造業者（Lionex、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）によって製造された。簡単に説明すると、DST-F 融合タンパク質を大腸菌 (E. coli) で発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製し、10 mM NH4HCO3 (pH 8.0) に対してリフォールディングし、PBS (pH 7.4) に対してバッファー交換し、最後に PBS でさらに希釈しました。瓶詰めする前に濃度 300 µg/ml を、密閉栓付きの EP タイプ 1 ガラスバイアルに入れ、アルミニウムキャップで密封します。バッチ放出基準には次のものが含まれます：タンパク質含有量 300 μg/ml ± 5%。抗ヒスチジンタグおよびタンパク質特異的抗体を使用した場合に陽性反応が示されたが、抗E. 大腸菌抗体。 SDS-PAGE および濃度測定分析を使用した純度は 95% 以上。エンドトキシン含有量が 25 IU/mg 未満。無菌性は欧州薬局方モノグラフ 2.6 に準拠しています。

皮膚検査は、APHA Vet Gateway から入手可能なウシの結核検査に関する指示に従って実施されました。簡単に言うと、動物の両側の首の前部と中央の3分の1の境界に位置する注射部位を切り取り、注射前の皮膚の厚さを記録した。ツベルクリンおよび DST-F 皮膚検査は、それぞれ 0.1 ml の PPD-A および PPD-B、または DST-F 試薬の皮内注射によって実施されました。 72 時間後、皮膚の触診により皮膚試験部位の反応をチェックしました。明白な反応が検出された場合、注射部位の皮膚の厚さを再測定して記録した。明白な反応が検出されなかった場合は、注射前の値が使用されました。例外は GLP 安全性研究 (研究 8 および 9) で、72 時間後の皮膚の厚さが自動的に測定されました。結果は、注射前の厚さと比較した72時間後の皮膚厚の増加として表されます。各実験の皮膚テストのタイミングの詳細を表 1 に示します。

分析は、GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, USA) を使用して実行されました。 BCG ワクチン接種を受けた子牛と対照の子牛の病理の程度を、マン・ホイットニー検定を使用して比較しました。マクネマーの一致対検定またはフィッシャーの直接確率検定を必要に応じて使用して、検査陽性と陰性の割合を比較しました。 0.05 未満の p 値は統計的に有意であるとみなされました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、イングランド、スコットランド、ウェールズを代表してDefraが集中管理するGBウシ結核研究予算（補助金SE3304およびSE3312）によって資金提供された。著者らは、APHAで飼育されている動物の福祉に尽力してくれた動物科学ユニットのAPHAスタッフと、DST-F安全性研究を実施してくれた科学サービスユニットのAPHAスタッフ、およびDST-F安全性研究について相談とアドバイスをくれたスティーブ・ホートン博士に感謝したいと思います。 DST-F 試薬の動物実験証明書申請の規制要件。

結核免疫学およびワクチン学、動植物保健庁細菌学部、ニューホー、アドルストン、KT15 3NB、サリー州、英国

ギャレス・J・ジョーンズ、ティム・コノルド、シェリーン・ハーリー、トム・ホルダー、ザビーネ・スタインバック、ミック・コード、H.マーティン・フォルダーマイヤー

AgResearch、パーマストンノース、ニュージーランド

D. ニール・ウェドロック & ブライス・M. バドル

Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH、ブラウンシュヴァイク、ドイツ

マハービア・シン

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HMV と GJJ は DST-F コンセプトを開発しました。 MS は DST-F 試薬の製造を開発しました。 HMV、GJJ、DNW は実験を計画し、動物実験を調整しました。 TK、SH、TH、SS、MC、および BMB は動物研究および/または実験室実験を実施しました。 GJJはデータを分析し、表と図を作成しました。 GJJが執筆したテキストをHMV、DNW、MSが編集

ギャレス・J・ジョーンズへの通信。

HMV、GJJ、TK、SH、TH、SS、および MC は、ウシ結核の診断検査における Rv3615c の使用に関する 3 つの特許を保有する動植物衛生庁 (APHA) によって採用されています (WO/2009/060184、WO/2011) /135369およびWO/2012/010875）。 APHA での研究は、イングランド、スコットランド、ウェールズを代表して Defra が集中管理する GB 牛結核研究予算によって資金提供されています。 MS は Lionex GmBH の所有者であり、同社の株式を所有しています。残りの著者 (DNW および BMB) は、潜在的な利益相反はないと宣言しています。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ジョーンズ、GJ、コノルド、T.、ハーレー、S. 他試験性能データは、BCG ワクチン接種と互換性のある牛 DIVA 皮膚試験試薬 (DST-F) の有用性を示しています。 Sci Rep 12、12052 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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受信日: 2022 年 5 月 9 日

受理日: 2022 年 7 月 1 日

公開日: 2022 年 7 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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科学レポート (2023)

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