異なる電気刺激下におけるミミズ粘液の組成変化と生態学的特徴

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2332 (2023) この記事を引用

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ミミズの粘液には、有機物の石灰化と腐植化を開始する栄養素が豊富に含まれており、汚染土壌の浄化と汚泥の再利用にとって非常に重要です。 この研究では、6 つの電圧と電流の組み合わせを利用してミミズの粘液生成を促進し (それぞれ 10、20、30 mA で 5 V と 6 V)、さまざまな電気刺激下で生成される粘液の組成変化を調査し、次のことを提案しました。土壌重金属汚染の修復と汚泥の再利用に適用できる最適な電気刺激グループと粘液画分。 その結果、6つの電気刺激によって生成された粘液は、主にタンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、多糖類で構成され、少量のアルコール、フェノール、エステル有機物質が含まれていることがわかりました。 異なる電気刺激下では、各成分は大幅に変化しました (P < 0.05)。 pH と導電率は 6 V 20 mA でより高く、総窒素とリンの含有量は 5 V 30 mA で最大に達し、総カリウムは 6 V 10 mA で最大に達しました。 タンパク質、アミノ酸、炭水化物は 5 V 10 mA で生成される粘液中に最も豊富に含まれますが、微量金属元素は 5 V 10 mA で最低値に達します。 最終的に、主成分分析に基づいて、以前の研究と組み合わせて、5 V 10 mA で生成された粘液は弱アルカリ性で、アミノ酸と栄養素が多く、微量金属元素が少なく、汚泥とわらの堆肥化に最適であると結論付けられました。実験、土壌浄化および改良実験。

ミミズは土壌に生息する無脊椎動物であり、土壌生態系の生態工学者として機能することがよくあります1。 巨視的な観点から見ると、ミミズは穴を掘ったり、採餌したり、移動したり、投げ込んだりすることによって土壌集合体の形成を促進し、土壌の石化レベルを高め、土壌の浸透性を改善し、保水能力を高めます。 ミミズの鋳物には、腐植質や植物の栄養素、そして無公害で持続可能で効率的な有機肥料も豊富に含まれています2、3、4。 顕微鏡レベルでは、ミミズは微生物群集の豊かさと多様性を変えることができ、それによって有機物の利用を促進し、また重金属を吸収して濃縮する能力もあります5,6。 ミミズとその周囲の環境を総称して「ミミズふれあいサークル」ともいいます。 ミミズが「ミミズ接触サークル」で活動すると、ミミズの自然な保護バリアである刺激臭のある淡黄色の粘液が表皮から放出されます。 さらに、この粘液には、ミミズの成長、発育、生殖、抵抗力に不可欠なタンパク質、アミノ酸、炭水化物、その他の物質が含まれています7、8、9。

研究によると、ミミズの粘液には免疫細胞、抗菌ペプチド、抗菌タンパク質、および食作用の役割を果たし、細菌に対する抵抗力を与え、ミミズを病原体から守る血球凝集作用が含まれていることが示されています10。 粘液には、殺虫性、抗真菌性、抗ウイルス性のタンパク質や、フザリウム・オキシスポラムやカンジダ・アルビカンスなどの植物病原体の成長を阻害する植物ホルモンなどの化合物も含まれており、それによって種子の発芽が改善され、植物の成長の可能性が促進されます10,11。 ミミズの粘液は、土壌や植物の成長にも特に役立ちます。 粘液中のアミノ酸は吸収されやすい液体肥料であり、植物に豊富な栄養素を提供し、トマトの苗の成長とカドミウム耐性を促進し、植物内のカドミウムの蓄積を増加させ、また基質内の微生物の活動を強化し、それによって微生物の濃縮を増加させます。 3.4 ～ 11 倍 4、5、12。 Bityutskii ら 13 は、粘液が植物残渣の石灰化と腐植化のレベルを促進および促進し、その結果腐植質組成に強い質的変化が生じることを発見しました。 同様に、Pan et al.14 は、粘液には、有機汚染物質を効果的に複合化し、土壌中の有機汚染物質の分布を変化させ、汚染物質の生物学的利用能を改善し、バイオレメディエーションを促進するリガンドが含まれていることを発見しました。 Sizmur et al.15 はまた、粘液が汚染土壌中の重金属ヒ素の輸送と形態に重大な影響を与えていることも発見した。

したがって、粘液は、有機物の安定化、微生物群集の継承、重金属の制御、種子の発芽、植物の害虫と病気の蔓延、植物の成長、および土壌の修復において重要な生態学的役割を果たし得る。 現在、粘液の抽出方法は、天然水、蒸留水、撹拌、熱刺激、滅菌水、珪砂、電気刺激法など複雑かつ多様であり、中でも珪砂6と電気刺激法16は、その優れた特性から科学実験研究で広く使用されています。抽出が容易で、回収効率が高い。 ただし、粘液の物理化学的特性は抽出方法によって異なる可能性があります 7、11、17。 これまでに、Sizmur et al.15 は、珪砂法を使用してミミズが生成する粘液をさまざまな密度で抽出し、粘液の物理化学的特性に大きな変化があることを発見しましたが、刺激によって生成される粘液の特性の変化の特徴を報告した詳細な研究はほとんどありません。さまざまな電圧と電流を持つミミズ。 したがって、本研究の目的は、異なる電気刺激処理下でのミミズの粘液特性の変化パターンを調査し、土壌重金属汚染の浄化と汚泥の再利用に適用できる粘液成分と電気刺激処理グループを決定して、たとえば、汚染土壌浄化や汚泥資源回収への粘液の応用に関するその後の生態学的研究のための基礎データ参照。

この実験では、小林ら 18、Aja ら 16、AIlegretta ら 19 によるミミズへの 5 V および 6 V の電気刺激後の、血液やその他の液体汚染のないミミズ粘液の抽出に基づいて、電流低電圧 (5 V、6 V) と低電流 (10、20、30 mA) を組み合わせた方法を適用した後、ミミズ粘液を精製し、抽出しました。 (1) 異なる電気刺激によるミミズ粘液の物理化学的因子と栄養成分の変化、(2) 有機官能基とアミノ酸含量の変化、(3) 粘液中の物理化学的因子、栄養成分、アミノ酸の相関関係を調査しました。 、（4）微量元素含有量の変化、（5）因子主成分分析、（6）さまざまな電圧および電流設定下での粘液生成の最適な研究目標。

この研究で説明されているすべての実験手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実行され、ARRIVE ガイドラインに準拠しています。 ミミズ (Eisenia foetida) は、中国江蘇省ジュロンのミミズ繁殖センターから購入しました。 購入したミミズは 7 日間実験室に順応させた後、粘液抽出を行いました。 強い身体活動と明白な輪帯を持つ体重 0.35 ～ 0.5 g の成体ミミズを選択し、蒸留水ですすぎ、暗所の排泄箱に 24 時間置き、その後再びすすいで乾燥させました。 ミミズを 6 つの 300 g グループに分け、調整可能な DC 電源を使用して 5 V (10、20、30 mA) および 6 V (10、20、30 mA) で電気刺激して、ミミズ粘液の分泌を誘導しました。 60 秒の間隔で区切られた 3 回の 60 秒の電気刺激が、6 つの治療グループのそれぞれに対して実行されました。 この操作を各処理群につき３回繰り返し、合計５４００ｇのミミズを使用した。 ミミズは電気ショックにも耐え、さらなる飼育のために実験室のミミズ孵卵器に戻されました。 電気刺激を受けた各グループから得られた粘液の量は約 25 ～ 30 g でした。 収集した粘液を 5031 xg で 10 分間遠心分離して、細胞成分を含まない純粋なミミズ粘液上清を得、その後の測定のために -20 °C の冷凍庫に保存しました。

pH と電気伝導度 (EC) は両方とも、Nadana らによって記載された方法を使用して、卓上酸性度計と卓上導電率計によって測定されました11。 全窒素 (TN) と全リン (TP) はアルカリ過硫酸カリウム併用法 20 によって測定され、全​​カリウム (TK) は過塩素酸-フッ化水素酸消化によって測定されました 7。 アミノ酸画分は、食品中のアミノ酸の測定に関する中華人民共和国国家基準 (GB 5009.124-2016)21 に記載されている方法に基づいて次のように測定しました。 まず、粘液５ｍＬに６ｍｏｌ／Ｌ塩酸５ｇを混合した。 次に、乾燥窒素吹き込み装置 (LICHEN、LC-DCY-12G) を使用してチューブを窒素で 15 分間フラッシュし、密閉し、110 °C のオーブンに 22 ～ 24 時間置きました。 得られた溶液を冷却し、超純水を加えて１００ｍＬに定容した。 次いで、固定溶液２ｍＬを窒素吹き込み装置内で乾燥するまで脱酸し、２ｍＬのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨｄ）で溶解した。 溶液を溶解、振盪、混合し、アスパラギン酸 (Asp)、スレオニン (Thr)、セリン (Ser)、グルタミン酸 (Glu)、グリシン (Gly)、アラニン（Ala）、システイン（Cys）、バリン（Val）、メチオニン（Met）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、日立アミノ酸分析装置 (Hitachi L-8900) を使用したアルギニン (Arg) とプロリン (Pro)。

Aja et al.16 によって記載されているフーリエ変換赤外分光法 (FTIR) 法を使用して、5 g のミミズ粘液を真空凍結乾燥機 (LGJ-18S、Shanghai Yuming Instrument Equipment Co, LTD.、上海、中国) で凍結乾燥しました。 ）-50℃で。 48 時間後、乾燥した粘液サンプルを取り出し、メノウ乳鉢で保証試薬の臭化カリウムと混合し、100 MPa の打錠機で均一な透明なフレークに粉砕し、フーリエ変換赤外分光計 (Nicolet IS50、Thermo Fisher、 Waltham、MA、USA)、スキャン数を 65 に設定し、スペクトル範囲を 400 ～ 4000 cm-1 に設定し、データは 4 cm-1 の解像度で記録されました。 ミミズ粘液の水分含有量は、真空凍結乾燥機 (LGJ-18S、Shanghai Yuming Instrument Equipment Co, LTD.、上海、中国) での凍結乾燥法によっても測定されました。 5 V 10 mA、5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V 20 mA、および 6 V 30 mA の電気刺激によって生成された粘液水の含有量は、98.9%、98.7%、98.8%、99.2% でした。 、それぞれ98.9%と98.7%。

微量金属元素は、Chen et al.22 によって記載された方法を使用して分析されました。 まず、粘液 0.5 mL と濃硝酸 8 mL をるつぼで混​​合し、電気ホットプレート上で 140 °C、160 °C、180 °C の温度勾配でゆっくり加熱して 1 mL まで蒸発させました。冷却後、微多孔膜を通して濾過した。 その後、超純水をサンプルに加えて体積を 25 mL にし、ICP-MS (NexION300X、PerkinElmer、Wellesley、USA) を使用して次の微量元素を分析しました: Al、Mg、Fe、Cu、Cr、Zn 。 Mn、Ni、Pb、および K。分析および試験中の品質管理のために、重複サンプルとブランク試薬を含む国家標準が分析されました。サンプル回収率と相対標準偏差は 10% 未満であり、実験要件を満たしていました。

平均および標準偏差の計算には、Excel 2021 (Microsoft Corp.、米国ワシントン州レドモンド) および SPSS24 (IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用してデータ処理を実行しました。 単一因子分散分析 (ANOVA) と多重比較 (LSD) を使用して、異なる電気刺激条件下で粘液中の物理化学的因子、栄養元素、微量金属元素を分析し、有意性を 0.05 および 0.01 レベルで決定し、フーリエ変換赤外分析を行いました。相関分析、主成分分析、および従来のグラフ作成は、ORIGIN2021 (OriginLab、ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国) を使用して実行されました。

粘液には、カリウム、多価カルシウムおよびマグネシウムイオンなどの電解質が含まれており、ミミズの体の浸透圧調節に関与して生物の代謝バランスを維持します7,23。 ミミズがさまざまな刺激にさらされると、粘液の組成が変化します10。 図1aに示すように、ミミズは6つの異なる電気刺激間でpHとECに有意な（P < 0.05）差がある粘液を生成しました。 粘液の pH は一貫して弱アルカリ性 (7.50 < pH < 8.00) を示し、5 V 10 mA で最大値 7.85 に達しました。 粘液の pH も、電圧と電流の増加に伴ってさまざまな程度に低下する傾向を示し、その低下はほとんどの刺激で有意であり (P < 0.05、有意ではなかった 6 V 20 mA を除く)、最小値は 7.54 でした。 5V30mAで発生しました。 しかし、異なる電気刺激によって誘発された粘液の EC 値はさらに変化しました。 EC はすべてのグループ間で有意に異なり (P < 0.05)、6 V での変動は 5 V での変動よりも明らかでした。さらに、最大値と最小値の両方が 6 V で現れ、6 V 10 mA および 6 V の EC 値は6 V 20 mA は、他の処理 (5 V 10 mA、5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 30 mA) よりも 1.5​​ ～ 2 倍高かった。 したがって、異なる電気刺激は、粘液 EC において明らかに異なる効果を誘発しました。

さまざまな電気刺激によって引き起こされるミミズの粘液中の物理化学的因子と栄養成分の変化。 5.10、5.20、5.30、6.10、6.20、6.30はそれぞれ5V 10mA、5V 20mA、5V 30mA、6V 10mA、6V 20mA、6V 30mAを示します。 データは、3 つの重複実験の平均 ± SD として表示されます (n = 3)。異なる治療グループ間の有意差を検定するために、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用しました。 異なる小文字は、異なる電気刺激下での同じ指数の有意な差を示します (P < 0.05)。 EC電気伝導度、TN全窒素、TP全リン、TK全カリウム。

細胞の外部刺激は物質の分布と細胞膜表面の電位を変化させ、それが膜透過性に影響を与え、pH24、25を変化させます。 粘液はミミズの表皮の最も外側の柱状腺細胞と体細胞内腔細胞によって生成されるため、異なる強度で電気刺激を与えると pH と EC の両方が変化します。 電気刺激の強度が増加すると、細胞膜の透過性が徐々に増加し、細胞内の小さな有機酸、NH4+、およびその他の酸の分泌が促進され、その結果、pH12、26が徐々に低下します。 膜透過性の変化により、無機塩、代謝老廃物、ミネラルの放出も増加し、一部のミネラルも電解イオン化の形で可溶性の形態に変換され27、電圧とともに増加するように粘液のECが変化し、その結果、粘液の EC は 6 V 30 mA で急激に減少しました。 この時点では、おそらく刺激によって細胞膜の完全性は破壊されておらず、ミミズはより強い電気刺激のストレスに応答して体液の恒常性を維持するために、物質の流出を減らしながら粘液を分泌したと考えられます。

粘液には、N、P、K などの植物の成長に必要な栄養素が含まれているため、さまざまな電気刺激下で生成される粘液の栄養素含有量の変化を研究することが重要です17。 図1bに示すように、TNとTKの含有量はそれぞれ6 V 30 mAと5 V 30 mAで最も低く、他の処理グループよりも大幅に低いレベルでした（注：全窒素の他の処理グループは5 Vでした） 10 mA、5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V 20 mA、総カリウムは 5 V 10 mA、5 V 20 mA、6 V 10 mA、6 V 20 mA、6 V 30 mA; P < 0.05）、残りの 5 つのグループ間に有意差はありませんでした（注：全窒素の他の治療グループは、5 V 10 mA、5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V 10 mA、6 V 10 mA、6 V 10 mA、6 V 10 mA V 20 mA、総カリウムは 5 V 10 mA、5 V 20 mA、6 V 10 mA、6 V 20 mA、6 V 30 mA; P > 0.05)、5 V および 6 V で TN と TK が高く、それぞれ。 電気刺激間の TP の変動は大きく、電気刺激処理は TP 含有量の降順でランク付けできます: 5 V 30 mA、5 V 20 mA、6 V 30 mA、6 V 20 mA、6 V 10 mA、5V10mA。 TP 含有量は 5 V で最も低くなりますが、TP 含有量は一般に 5 V 電圧の方が高くなります。

粘液には、N、P、K が比較的豊富に含まれています。粘液 N は主に、NH4+、尿素、小分子代謝物、アミノ酸、タンパク質などの物質に由来しています 26,28。 対照的に、粘液 P は細菌微生物および有機リン化合物に由来し 7、粘液 K は主に細胞質および電解質に存在します 29,30。 5 V の電圧刺激下では、ミミズの体表は通常、植物に必要なさまざまな栄養素を含む粘液を放出します。 電圧が6Vに増加すると、ミミズに対する刺激と圧力が増加し、より多くの粘液の放出が誘発され、ミミズは体液中のナトリウムイオンとカリウムイオンのバランスを維持するために、より多くのカリウムイオンを粘液中に放出しました。 、6 V31 ではカリウムイオン含有量が高くなります。 細胞膜はプロセス全体を通じて無傷で活性なままでしたが、依然として有機物質に対して選択的に透過性があり、粘液への有機物質の過剰な流入を許可しませんでした32。 したがって、有機物画分からの N と P は 5 V で高く、無機塩イオン K は 6 V で高くなります。

FTIR スペクトルは、有機物質の化学構造と官能基を反映できます。 したがって、さまざまな電圧と電流の組み合わせの下で生成されたミミズ粘液の赤外スペクトルは、粘液のすべてのグループの吸収ピークが3432 cm-1、2965〜2873 cm-1、1647 cm-1、1575 cm-1、1408 cm-1に現れたことを示しています。 cm−1、1315cm−1、1085〜1045cm−1、および769〜540cm−1（図2）。 さらに、各処理間で、波形と山は非常に類似していましたが、山の強度は大きく変化していました。 3432 cm-1 の吸収ピークは炭水化物とタンパク質に対応し、2965 ～ 2873 cm-1 の吸収ピークは主に C-H3 および C-H の逆対称伸縮振動を受ける脂肪酸に対応します。 1647 cm-1 のピークは、アミド I バンドと多糖類の吸収ピークの C = O 伸縮結合、NH 屈曲および CH 可変角度振動に対応します。一方、1575 cm-1 に現れるピークは、おそらく C-C のアミド II バンドです。 N 方向のストレッチと N-H 方向の曲げ。 1408 cm-1 のピークは、C-O 非対称伸縮、O-H 曲げ振動、およびカルボキシル基からの COO- の対称伸縮に起因すると考えられますが、エーテル、フェノールの C-O 伸縮振動および O-H 平面曲げ振動そしてエステルは 1315 cm-1 に現れるでしょう。 1085 ～ 1045 cm-1 の幅広いピークは、主にアルコールと多糖類の C-O-C および C-H-O 官能基、H-C-H 伸縮振動、および O-C-N 屈曲に対応します。アミド IV の面 C = O 屈曲とアミド V の面外 N–H 屈曲は 769 ～ 540 cm−17,16,33,34 に現れます。 したがって、この実験のミミズ粘液は、主にタンパク質、炭水化物、脂肪酸、多糖類から構成されており、アルコール、フェノール、エステルなどの有機物が少量含まれていることが明らかです。 したがって、タンパク質と炭水化物の吸収スペクトルが大幅に支配的であり、これは Guhra et al.7 の結果とも一致しています。

フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) の官能基は、さまざまな電気刺激下でミミズ粘液中で変化します。 5.10、5.20、5.30、6.10、6.20、6.30はそれぞれ5V 10mA、5V 20mA、5V 30mA、6V 10mA、6V 20mA、6V 30mAを示します。

400 ～ 4000 cm-1 のスペクトル範囲の 6 つのバンドのうち、3432 cm-1、1647 cm-1、および 1575 cm-1 が最も支配的な 3 つの吸収バンドであり、水溶性タンパク質とアミド I および II バンドを表しています。 、 それぞれ。 さらに、タンパク質を構成する 20 アミノ酸のうち 9 アミノ酸はアミド I および II バンドに対応する強い吸光度を示したので、アミド I および II バンドはアミノ酸含有量も反映している可能性があります 16,35。 このバンドにおける 5 V 10 mA、6 V 10 mA、および 6 V 30 mA の吸光度は図 2 でより高いレベルにあり、タンパク質とアミノ酸の含有量が高いことを示しており、次に 5 V 20 mA が中央にあります。最後に、吸収波長が最も低い 5 V 20 mA と 6 V 20 mA です。 したがって、さまざまな電気刺激下で生成される粘液のタンパク質とアミノ酸の含有量が大幅に変化することがわかりました。これはおそらく、さまざまな刺激後の急性ストレスに応答する免疫機能を持つアミノ酸を分泌するミミズの防御タンパク質の存在によるものです36。 、37。

さまざまな電気刺激下での粘液中のタンパク質のアミノ酸変化のメカニズムをさらに説明するために、粘液中のタンパク質を加水分解し、粘液中の 17 アミノ酸の合計含有量の変化を分析しました 12。 表 1 に示すように、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、プロリン、およびロイシンが、観察された 17 アミノ酸の最も主要な成分 (44.6 ～ 47.4%) であり、グルタミン酸が 13.2 ～ 14.3% で最も豊富でした。シスチンは全アミノ酸の 0.3 ～ 0.4% のみを占め、粘液中には最も豊富に存在しませんでした。 6 つの電気刺激下では、大部分のアミノ酸が粘液中でそれぞれ 5 V 10 mA と 5 V 20 mA で最高レベルと最低レベルに達し、総濃度は 4.3 と 3.6 mg/g になりました。 6 V 治療グループでは、5 V で大きな変動はなく、より緩やかに変化しました。刺激は、アミノ酸含有量の降順で次のようにランク付けできます: 5 V 10 mA、6 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V20mA、5V30mA、5V20mA。 アラニン、シスチン、およびアルギニンを除くすべてのアミノ酸の中で、5 V 10 mA 粘液のアミノ酸含有量は、他の治療グループのアミノ酸含有量よりも高かった。 このうち、5 V 20 mA では、5 V 10 mA に比べてグリシン、フェニルアラニン、スレオニン、プロリン、チロシンの含有量がそれぞれ 32.4%、28.4%、28.0%、26.4%、26.1% と、より高い割合で減少しました。 。 比較すると、アラニンとシスチンは 5 V 30 mA で最大値に達し、5 V 10 mA と比較して 13.8% および 16.0% 上昇し、6 V 30 mA のアルギニンは最大値に達し、5 V 10 mA より 8.4% 高くなりました。 V10mA。

この粘液には、アミド I および II バンドに相当する 9 つのアミノ酸のうち、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、チロシン、アルギニン、ヒスチジンの 7 つが含まれており16、全アミノ酸の 47.3 ～ 48.8% を占めています。この内容は図 2 とも一致しています。グルタミン酸は中枢神経系に最も豊富に存在する興奮性神経伝達物質であり、中枢神経系を安定させることができ 38、アスパラギン酸は神経系の発達とホルモン調節に関連する重要な役割を果たします 39。 さらに、リジンには外部刺激に対するストレス保護機能もあります40。 したがって、粘液中にはこれら 3 つのアミノ酸の含有量が多くなります。 ミミズの粘液も刺激下でアミノ酸画分の変化を示しました。 例えば、ミミズを Cu に曝露すると、解毒機構を持つヒスチジン 41 が生成され、農薬への曝露によりイソロイシン、アラニン、グルタミン酸 42 が大幅に増加します。これらはミミズ曝露試験の指標としても使用できます 43。 したがって、ミミズは電気刺激を受けると、ストレス反応を通じて体液環境を変化させて身を守ります。 例えば、アスパラギン酸は心筋に対する保護効果があり、電気刺激によりその分泌が変化し、動物の心筋の電解質バランス、ひいては心筋機能が維持される可能性がある39。 さらに、グルタミン酸は電気刺激下でミミズの中枢神経系に影響を与え、その分泌は実際に変化しました。 ミミズはまた、損傷から身を守るために防御タンパク質も生成し、Roch らによって特定された 5 つのミミズ防御タンパク質にも 16 個のアミノ酸が存在します。 これらの防御タンパク質はミミズを保護するために粘液にも存在します。 したがって、ミミズは、さまざまな電気刺激を受けたときに、体内の恒常性を調節するためにさまざまなアミノ酸を生成し、費用対効果の高い方法で損傷から身を守ることができることは明らかです。 調べた 6 つの電圧と電流の組み合わせの中で、5 V 10 mA はミミズへの刺激が最も少なく、最も豊富なレベルのアミノ酸を誘導しました。

粘液中の物理化学的因子、栄養元素、アミノ酸は、植物の成長、有機物の無機化、土壌浄化、汚泥堆肥の安定化に重要であり、粘液の性能を評価するための現在の基準の 1 つです。 したがって、相関分析を実施して、異なる電圧電流間の固有の関係を調査することが重要です5、7、12、16。 図 3 に示すように、pH と TP (P < 0.05)、EC と Ala (P < 0.01)、TP と Leu および Pro (P < 0.05)、および pH と Met (P < 0.05) には有意な負の相関関係がありました。 ）さまざまな電圧と電流の組み合わせで、アミノ酸レベル間の相関関係はより密接に変化しました。 10 個のアミノ酸 Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、Pro の含有量はすべて、互いに有意な正の相関関係を示しました (P ≤ 0.05、Ile、Ser、Leu、Phe、Lys を除く) ）、Glu、Tyr、および His のレベルも相互に有意な正の相関を示しました（P ≤ 0.05）。 しかし、Ala、Cys、Met、および Arg のレベルは、相互または他のアミノ酸のレベルと有意な相関はありませんでした (P > 0.05)。 実際、アミノ酸レベル間の正の相関は、共通の起源を示している可能性があります 45。 さらに、表１のデータに基づいて、Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、Proが同様の傾向を示し、Glu、Tyr、Hisもほぼ同様の傾向を示すことが判明した。 。 したがって、Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、および Pro は、さまざまな電圧と電流の組み合わせでの粘液の生成において同じ起源を持つようであり、Glu、Tyr、および His も同様に粘液の生成に起源を持ちます。同じソース条件です。

異なる電気刺激下でのミミズ粘液中の物質の含有量間の相関。 赤と青は、それぞれ有意な正と負の相関を示します。 赤または青の色が濃いほど、相関係数の絶対値は大きくなります。 ** は相関が 0.01 レベルで有意であることを意味し、* は相関が 0.05 レベルで有意であることを意味します。

図4に示すように、異なる電気刺激下で生成された粘液中には、Al、Mg、Fe、Cu、Cr、Zn、Mn、Ni、Pbの9種類の微量金属元素が含有量の多い順に同定されました。 これらの微量元素のうち、その含有量は 652.6 ～ 1159.8 μg/g、392.4 ～ 697.8 μg/g、36.4 ～ 64.7 μg/g、29.7 ～ 47.9 μg/g、12.7 ～ 22.7 μg/g、8.8 ～ 17.3 μg/g、それぞれ4.7～9.3μg/g、1.3～2.9μg/g、0.14～0.25μg/g。 AlとMgの含有量は他の金属元素よりもはるかに高くなります。 さまざまな電気刺激下でミミズが生成する粘液では、6 V 20 mA の Cu を除き、すべての金属元素の含有量が 5 V 10 mA で最も低くなりました。 このうち、Al、Mg、Fe、Cr、Zn、Mn、Ni、Pb の含有量は、5 V 10 mA で他の処理群と比較して 22.6 ～ 77.7%、22.5 ～ 77.8%、17.3 ～ 77.8% 有意に減少しました。 、32.3 ～ 79.0%、46.9 ～ 96.7%、46.1 ～ 97.1%、78.1 ～ 114.4%、および 36.4 ～ 79.4% (注: 他の治療グループは 5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6それぞれ V 20 mA、6 V 30 mA、P < 0.05)。 さらに、6 V 30 mA での Cu 含有量は他の処理グループよりも大幅に低く、25.5% ～ 61.2% でした (注: 他の処理グループは 5 V 10 mA、5 V 20 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V 30 mA、それぞれ、P < 0.05)。 9 つの金属元素の傾向を分析した結果、Al、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn の含有量の差は、電圧と電流の組み合わせが異なってもほぼ同じであり、それらの含有量はすべて同じ降順でランク付けできることがわかりました。処理に応じた順序: 5 V 20 mA、6 V 30 mA、5 V 30 mA、6 V 10 mA、6 V 20 mA、5 V 10 mA (5 V 10 mA の Cu および 6 V 20 mA の Zn を除く) 。 これらの処理間では微量金属レベルに有意な差があり(P < 0.05)、Cr、Ni、Pb は同様の変化傾向を示しましたが、複数の電気刺激処理間では有意差はなく (P < 0.05)、ばらつきが小さくなりました。金属元素レベルで。

電気刺激ごとのミミズ粘液中の微量元素の違い。 5.10、5.20、5.30、6.10、6.20、6.30はそれぞれ5V 10mA、5V 20mA、5V 30mA、6V 10mA、6V 20mA、6V 30mAを示します。 データは、3 つの重複実験の平均 ± SD として表示されます (n = 3)。異なる治療グループ間の有意差を検定するために、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用しました。 異なる小文字は、異なる電気刺激下での同じ指数の有意な差を示します (P < 0.05)。

ミミズは土壌生態系の生態工学者として、さまざまな金属元素を生物蓄積して利用することができるため、ミミズの体内の金属元素の含有量も環境に依存します46。 例えば、Song ら 47 は、豚糞尿とキノコ残渣の混合基質に生息するミミズの Cu、Zn、Pb 含有量が大幅に増加することを発見し、一方 Zhang ら 48 は、ミミズが高濃度の土壌に生息することを発見した。 Cu、Cd、Pb、Zn による汚染も、体内の金属含有量が増加していました。 これに対し、本実験のミミズは、発酵させた牛糞と泥の混合基質の中に生息しており、ミミズが成長・繁殖するにつれて、基質中の金属元素が体内に蓄積し続け、粘液中の金属元素の含有量に影響を与えた。 おそらく基質のため、そしておそらく Al と Mg が重要な生物学的役割を持っているため、Al と Mg の含有量はより高かった 49。 ミミズが異なる電気刺激を受けた後、産生される粘液中の各金属元素の含有量がある程度変化したのは、細胞膜表面の膜電位や浸透圧など、細胞内外の金属元素の輸送機構が変化したためと考えられます。細胞内外の圧力、タンパク質自体の輸送49。 同時に細胞は、金属イオンを区別するために金属イオンの貯蔵を調節するセンサーも備えているため、電気刺激が変化すると金属イオンの調節も変化し50、金属イオンの放出も変化した。

さまざまな電圧と電流の組み合わせが、生成される粘液中の物理化学的因子、栄養素、アミノ酸、微量元素に及ぼす影響をさらに明らかにするために、主成分分析（PCA）が実施されました（図5）。 PCA に基づくと、2 つの主成分の累積分散寄与率 77.57% が観察され、最初と 2 番目の主成分 (それぞれ PC1 と PC 2) が分散の 63.8% と 13.8% を占めました。 図 5 に示すように、5 V 10 mA と 6 V 30 mA は、それぞれ PC1 方向と PC2 方向の各要因に対して顕著なプラスの影響を及ぼし、5 V 20 mA と 6 V 20 mA は、各方向の各要因に対して顕著なマイナスの影響を及ぼしました。それぞれ PC1 方向と PC2 方向。 したがって、5 V 10 mA と 6 V 30 mA の両方、および 5 V 20 mA と 6 V 20 mA の両方が、それぞれ粘液画分のさまざまな因子の高レベルと低レベルに影響を与える主要な電気刺激グループであることは明らかです。 さらに、各因子の 2 つの主成分に対する因子負荷量を決定して、2 つの主成分に対する各因子の寄与をさらに明確にし、金属元素とほとんどのアミノ酸がそれぞれ PC1 に対して最も重大なマイナス効果とプラスの効果を持っていることを明らかにしました。 。 同様に、因子 pH、EC、TK、TP、および TK、および因子 Glu、Ala、Tyr、His、および Arg は、PC2 に対して最も顕著なマイナスおよびプラスの影響を及ぼしました。 図 5 は、異なる電気刺激によって生成された粘液画分の 3 つの集合も示しています。 したがって、pH、EC、TK、TK、および Met は 1 つのクラスターにさらに密に集合し、微量元素と TP は別のクラスターに集合し、アミノ酸の大部分は 3 番目のクラスターに集合しました。 このことから、5 V 10 mA で刺激した後に抽出した粘液はアミノ酸が豊富で金属元素が少なく、5 V 20 mA で刺激した後に抽出した粘液は金属元素が多くアミノ酸が少ないのに対し、 6 V 20 mA での刺激では、物理化学的因子と栄養素がより豊富に含まれ、アミノ酸と金属元素の平均レベルが高くなりました。

異なる電気刺激により誘発されるミミズ粘液の各因子の主成分分析。 5.10、5.20、5.30、6.10、6.20、6.30はそれぞれ5V 10mA、5V 20mA、5V 30mA、6V 10mA、6V 20mA、6V 30mAを示します。 EC電気伝導度、TN全窒素、TP全リン、TK全カリウム。

上記の分析から、6 つの異なる電圧と電流の組み合わせによって誘発されたミミズ粘液中の物理化学的因子、栄養元素、アミノ酸、微量元素が大きく異なることが明らかです。 したがって、ミミズ粘液の適用に関する研究対象は、組成によって変わる可能性があります。 表 2 に示すように、これは部分的にミミズ粘液に関する以前の研究に基づいていますが、土壌、堆肥、植物に重要な生態学的影響を与える可能性のある粘液は、次のような特定の特性を備えている必要があることは明らかです。中性 pH、低い EC、植物種子の発芽を促進する外因性アミノ酸プロテアーゼ含有量、液体肥料として植物の成長を促進する高アミノ酸タンパク質含有量、粘土鉱物および重金属錯体を吸着する能力。 栄養素の含有量が高いと、植物の成長を促進するだけでなく、土壌の石化と湿潤化を促進し、重金属を不動態化することもできます。 得られる粘液の微量栄養素含有量は植物が利用できる範囲内にあり、植物が必要とする微量栄養素をよりよく補充でき、基質内の有機物とミネラルの組み合わせに架け橋効果をもたらします。

本研究に基づいて、異なる電気刺激下で生成される粘液は異なる研究対象に適用できると暫定的に結論付け、提案することができます。 5 V 10 mA、6 V 10 mA、および 6 V 20 mA の刺激により、スラッジおよびわらの堆肥化試験、土壌浄化および改質試験、およびアミノ酸が豊富であるため有機残留物の石灰化および腐植化に使用される粘液を生成できます。含有量、栄養素含有量が高く、微量元素含有量が低い。 同じ条件下で、アミノ酸含量が最も高く、微量元素が最も少ない 5 V 10 mA 粘液を実験グループとして選択しました。 5 V 30 mA の刺激によって誘発された粘液は、最も中性の pH、より低いカリウムイオン含有量と EC、より高いレベルのアミノ酸、および中程度のレベルの微量元素を有しており、種子の発芽試験に使用できることを示しています。 6 V 30 mA で誘導された粘液には、植物に必須の栄養素、アミノ酸、微量元素が多く含まれているため、植物の成長および発育試験に特に適しています。 5 V 20 mA で刺激された粘液は、アミノ酸含有量は低いものの、栄養素と微量元素が最も豊富であったため、微量元素が欠乏している植物の肥料や土壌凝集構造検査の改善に使用できます。

さまざまな電気刺激によって誘発されたミミズ粘液には、アミノ酸、タンパク質、脂肪酸、多糖類、アルコール、フェノール、エステルなどの有機物質のほか、さまざまな微量元素が含まれていました。 6 つの異なる電圧と電流の組み合わせの下で生成された粘液では、pH、EC、TN、TP、TK、アミノ酸、および微量元素の変化が、おそらく細胞浸透圧、膜電位の変化、ナトリウムおよびカリウムのポンプ、および生体のストレス防御反応。 物理化学的特性とアミノ酸含有量の相関分析により、Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、および Pro は、異なる電気刺激下で一緒に変化するため、粘液中に同じ供給源があることが明らかになりました。一方、Glu、Tyr、および His も同様に同じソースメカニズムから生じました。 最後に、PCA と以前の研究に基づいて、5 V 10 mA で生成された粘液は汚泥とわらの堆肥化実験、土壌浄化と改質実験、有機残留物の石灰化と腐植化に適していると暫定的に結論付けられましたが、粘液は 5 V 10 mA で誘導されました。 V 20 mA は、微量栄養素が欠乏した植物の施肥や土壌集合体構造の実験に適していると考えられました。 さらに、5 V 30 mA の粘液は種子の発芽実験に適していると判断され、6 V 30 mA の粘液は植物の成長および発育試験に適していると判断されました。

現在の研究中に使用および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、2022年の淮北鉱業グループの科学技術研究開発プロジェクトからの財政的支援と、安徽開源造園工程有限公司からの支援に感謝する。

この研究は、中国国家自然科学財団 (51878004; 51978001; 42102204; 32001159) および国家重点研究開発プログラム「固形廃棄物リサイクル」主要プロジェクト (2020YFC1908601) によって支援されました。 この研究は、安徽省の主要研究開発プログラム (202104a06020027) および高層地下水採掘地域における水と土壌資源の包括的利用と生態保護の安徽省工学研究所開設財団 (2022-WSREPMA-04) によっても支援されました。 また、安徽省大学相乗イノベーションプログラム（GXXT-2020-075）の研究プログラム、金属鉱山安全衛生国家重点研究所のプロジェクト（2020-JSKSSYS-02）、主要支援プログラムにも感謝いたします。安徽省大学の優秀な人材 (gxyqZD2021129)、安徽科学技術大学重点プロジェクト、安徽科学技術大学蕪湖研究所 (ALW2020YF08)、淮南師範大学博士研究財団 (Bskyqdj2022)、博士研究基金安徽科学技術大学の博士号 (13210571)。 2021年は淮北鉱業グループ研究財団、2021年は淮南鉱業グループ研究財団に感謝します。

安徽省水・土壌資源工学実験室 高層地下水採掘地域における総合利用と生態保護、安徽科学技術大学地球環境学部、淮南、232001、中国

フアン・フイフイ、ワン・シンミン、ユー・シャオクン、ファン・ティンユー、スン・ルンタオ、ドン・ゾンビン、ザー・シージャオ

金属鉱山の安全衛生の国家重点研究所、中国鋼鉄馬鞍山鉱業研究所有限公司、馬鞍山、243000、中国

王興明 & ガン・リー

安徽省と教育省が共同設立した万江流域の劣化した生態系の回復と再構築の共同イノベーションセンター、安徽師範大学生態環境学部、蕪湖市、241002、中国

王興明＆朱暁夏

232001 中国、淮南市、安徽省の高潜水レベル鉱山地域における土壌および水資源の総合的利用と生態学的保護の工学研究所

王興明＆樊廷宇

環境に優しい材料と労働衛生研究所、安徽科学技術大学 (蕪湖)、蕪湖、241000、中国

王興明＆樊廷宇

安徽高等教育機関生物資源および環境バイオテクノロジーの主要研究室、生物工学部、淮南師範大学、淮南、232038、中国

Zhaoxia Chu & Xiaoping Xu

安徽理工大学土木建築学部、蕪湖市、230009、中国

徐小平

蚌埠市、233033、中国、蚌埠医科大学予防医学科

クアン・ジェン

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XW、ZC、XY がこのアイデアを考案しました。 HH、TF、GL、LS が実験を設計し、実施しました。 HH、XX、QZ はデータを分析し、数値を作成しました。 HH、ZD、SZ は結果を分析し、原稿を書きました。 著者全員が原稿をレビューしました。

王興明への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Huan、H.、Wang、X.、Chu、Z. 他。 さまざまな電気刺激下でのミミズ粘液の組成変化と生態学的特徴。 Sci Rep 13、2332 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29125-7

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受信日: 2022 年 10 月 8 日

受理日: 2023 年 1 月 31 日

公開日: 2023 年 2 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29125-7

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