ポイントの精度と使いやすさ

npj クリーンウォーター 6 巻、記事番号: 5 (2023) この記事を引用

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95 オルトメトリック

メトリクスの詳細

地生フッ化物は何千万もの人々の水を汚染します。しかし、検出方法の欠陥のせいで、多くの人はフッ化物の含有量に気づいていません。バイオセンサーテストは、これらの欠点の多くに対処する水質検査への比較的新しいアプローチですが、専門家以外によって「現実世界」の環境でテストされたことはありません。そこで私たちは、ケニアのナクル郡での調査とフィールドテストを使用して、ポイントオブユースフッ化物バイオセンサーの精度と有用性を評価しようとしました。バイオセンサーテストでは、テストした 57 サンプルの 89.5% で上昇したフッ化物 (≥1.5 ppm) を正確に分類しました。ユーザビリティも高かったです。すべての参加者はテストを使用することができ、1 つのサンプルを除いてすべてのサンプルを正しく解釈できました。これらのデータは、バイオセンサー検査により、専門家以外の人々が消費する水について決定を下すのに役立つ、正確で意味のある水質データを提供できることを示唆しています。これらのテクノロジーをさらに拡張することで、持続可能な開発目標 6 に向けた世界的な進歩を追跡するための新しいアプローチが提供される可能性があります。

水汚染とその結果として生じる健康と経済的負担は、差し迫った世界的な健康上の懸念です1。持続可能な開発目標 (SDG) 6 は、「すべての人のための水と衛生の利用可能性と持続可能な管理」に向けた進捗状況を追跡しています。 SDGターゲット6.1、「安全で手頃な価格の飲料水への普遍的かつ公平なアクセス」に向けた進捗状況は、主に各国統計局から国連児童緊急基金（ユニセフ）と国連児童基金（UNICEF）に報告された飲料水インフラへのアクセスに関するデータを使用して追跡されています。世界保健機関 (WHO) の共同モニタリングプログラム (JMP)2.

JMP データに基づく現在の推定では、世界中で 20 億人が安全に管理された飲料水サービスにアクセスできず2、2030 年までに目標 6.1 を達成する軌道に乗っていないことが示されています3。水質に関する現在のデータが限られているため、この推定でさえ楽観的すぎる可能性があります4。。具体的には、ガバナンスを推進するのに十分な堅牢な水質データを生成するリソースを持っているのは国連加盟国の半分未満です3。そのため、WHO が優先事項 5 として特定した水質汚染物質、具体的には大腸菌、ヒ素、亜硝酸塩、フッ化物 6 の存在を追跡するために、より広く利用可能なデータ収集技術の必要性が認識されています。

世界中の何千万人もの人々が使用する水源には、危険なレベルのフッ化物が検出されています7,8。 WHO6 が定めたカットオフ値である 1.5 ppm (または 1.5 mg/L) を超えるフッ化物濃度への曝露は、通常、天然に存在するフッ化物塩が地下帯水層に浸出するときに発生します。地下水中のフッ化物濃度の上昇は世界中で発生しており、アフリカ北部および東部、中東、南北アメリカの一部で特に懸念されています9,10。 1 ppm 未満のフッ化物曝露には、う蝕の予防 11 や骨粗鬆症の症状の治療 12 などの健康上の利点がありますが、高レベルのフッ化物への慢性曝露には多くの悪影響があり、最も顕著なのは歯および骨格のフッ素症 13 です。フッ素症は、歯や骨内のカルシウムと結合することでそれらをもろくさせ、衰弱性の生涯にわたる健康上の合併症を引き起こす可能性があります14,15。

有害な地生フッ化物への曝露を軽減するための最大の障害の 1 つは、その存在を特定することが難しいことです。水中のフッ化物は無色、無臭で、2.4 ppm 以下では味で検出できません16。幸いなことに、イオンクロマトグラフィーやイオン感知電極などの技術を使用して、実験室環境でフッ化物レベルを正確に定量するのは簡単です7。さらに、ナノモルレベルの分析物を検出できる最先端の蛍光プローブ 17、18、19 は、研究室ベースのサンプル分析にさらに簡単な方法を提供する可能性があります。ただし、これらのテクノロジーはすべて、運用に大規模なインフラストラクチャと専門知識を必要とするため、その使用には集中的なアプローチが必要です。一方、一元化されたアプローチでは、サンプルを現場で収集して研究室に輸送する必要があり、影響を受ける可能性のある地域での検査と結果の伝達に追加のコストと物流上の制約が生じます。

現在、これらの制限の一部を回避するための正確な使用時点技術が存在しますが、コスト、複雑さ、および/または精度の点で、専門家以外にとっての価値は限られています6。たとえば、ポータブルフッ化物検知電極と光度計は、現場で水中のフッ化物レベルを定量的に測定できますが、数百ドルから数千ドルの費用がかかり、使用するには校正手順とメンテナンスが必要です。使用時点のケミカルストリップは、1 回の検査あたり 1.00 米ドル未満の費用で現場に優しい代替手段を提供しますが、偽陰性が発生しやすく、非常に高レベルのフッ化物であっても識別できないことがよくあります20。そのため、使用時点でのフッ化物濃度が 1.5 ppm 以上の水源を正確に特定するために、専門家でなくても使用できる、正確で簡単かつ手頃な価格の方法が必要とされています。このようなテストは、人々が消費する水について決定を下すのに役立ち、SDG 6 に向けた世界的な進捗状況を追跡するのにも役立ちます。

無細胞バイオセンシング技術は、正確かつシンプルで手頃な価格の水質診断の開発に有望な戦略を提供します21。バイオセンサーは、細胞の健康に関連する化合物を感知する、細胞内に自然に存在する RNA またはタンパク質システムです。これらの自然なシステムは、RNA またはタンパク質と結合相互作用することで機能し、遺伝子の発現を引き起こし、その結果、化合物を代謝または輸送することができます。合成バイオセンサーは、これらの自然システムを細胞から抽出し、標的化合物の存在を示す視覚的に検出可能なシグナル（色の変化）をもたらす、遺伝的にコードされたレポーター遺伝子を発現するように再構成することによって作成できます。これらのシステムの主な長所は、それらが生細胞の外でインビトロ反応として機能するため、遺伝子組み換え生物ではないことです。さらに、凍結乾燥して保存できるため、製造や必要な場所への輸送が容易になります。したがって、水サンプルでテストを再水和することにより、使用時点での水質診断として使用できるようになります。さらに、バイオセンシング試薬の製造コストは、実験室（すなわち生産規模ではない）であっても、検査あたり数十セント程度かかります（検査と陽性対照で 0.73 米ドル）22。これにより、これらのコストは、ゴールドスタンダードの現場展開可能なテクノロジのコスト (0.89 米ドル、補足表 1) と同等になります。

フッ化物の検出については、バチルス・セレウスに由来する天然のフッ化物感知機構が、1 ppm という低いフッ化物レベルを検出できるバイオセンサーに組み込まれることに成功し、使用時点でのフッ化物検査に組み込まれています20。このテストは、対象の水サンプルで再水和すると、フッ素の存在下で数時間以内に目に見える黄色を生成する凍結乾燥バイオセンシング反応で構成されています (図 1)。この無細胞フッ素バイオセンサー試験は、フッ素化塩の供給源として知られるイラス火山に近いため地生フッ素濃度が高い地域であるコスタリカのカルタゴでの研究で最初に実地試験が行われた20。その研究では、テストはイリノイ州で製造され、民間航空機に搭載されて現場に運ばれました。博士課程の学生による9つの異なる地下水源および地表水源の検査では、陽性対照がすべての場合に機能することが明らかになり、検査の基本的な生化学が製造、輸送、および現場での使用に対して堅牢であることが確認されました。さらに、2 つのサンプルには検出可能なレベルのフッ化物が含まれていることが判明しました。この研究は有望ではありましたが、テストされた現場サンプルの数が少なかったこと、さらに重要なことに、実験技術とテスト操作の専門知識を持つ 1 人のユーザーによってテストが実施されたという事実によって限界がありました。ユーザビリティを評価するには、感度と特異度を計算するのに十分な大きさのサンプルサイズで、専門家以外でもテストを使用する必要があります。

センシング反応は準備され、凍結乾燥され、その後対象のサンプルで再水和されます。酵素反応はフッ化物の存在下で起こり、反応中の無色の基質が黄色の生成物に変換されます。

そこで私たちは、地因性フッ素汚染が知られている地域であるケニアのナクル郡で、生物工学による使用時点でのフッ素検査の精度と有用性を調査しました24,25。具体的には、ゴールドスタンダードの方法である測光と比較して、有害なフッ化物レベル（WHO により 1.5 ppm 以上と定められている6）を正確に感知する能力によって評価される検査精度の評価を目指しました（目的 1）。また、テストの再水和と解釈に関する報告されたユーザーエクスペリエンスによって評価されたユーザビリティもテストしました (目的 2)。

私たちは社会人口動態に関する情報を収集するために、各参加世帯のメンバー 1 名を対象に調査を行いました。飲料水源。フッ素とフッ素症に関する知識、態度、行動。家庭の水の不安の経験。次に、各参加者に最大 3 つの家庭用水源を提供し、それらを使用時点のバイオセンサーでテストするように依頼することで、バイオセンサーテストの精度を特徴付けました。 2 回目の調査は、同じ参加者に対して同じ日に実施され、バイオセンサーテストの使用と出力の解釈に関する経験を評価し、ゴールドスタンダードの方法、つまりフッ化物光度計を使用して得られたフッ化物濃度を確認して共有しました。データ収集については、補足図 1 に図示されています。

52 人の参加者から合計 90 個の水サンプルが収集されました。社会人口統計、フッ化物に関する知識、態度、行動、水の不安に関する経験は、52 人の参加者全員が入手できました。テストの精度 (目的 1) と解釈 (目的 2) の評価に利用できるサンプルサイズは、36 世帯から提供された 57 個の水サンプルでした。サンプル数が 90 から 57 に減らされたのは、最初のバッチのテストの輸送条件によりテストの劣化が生じ、精度と使いやすさの評価に不適切になったためです (「ケニアのナクル郡へのテストキットの輸送」を参照)。

この研究には、さまざまな学歴や雇用背景、世帯人数、水不安のレベルの参加者が含まれていました（表1）。参加者 52 名のうち大多数は女性 (73.1%) で、年齢中央値は 41 歳でした。参加者の約半数は少なくともある程度の中等教育を修了していました。参加者の職業は主に、農業、市場スタンドなどの中小企業、または失業者の 3 つの大きなカテゴリに分類されました。世帯月収は 0 ～ 9,500 KES (中央値 8.60 米ドル) の範囲でした。世帯人数の中央値は 5 人でした。世帯のほぼ半数には5歳未満の子供がいた。世帯の約 4 分の 1 が水の不安を抱えていました (HWISE スコア ≥12)。つまり、基本的な家庭のニーズを満たすために水を確実に入手するのに苦労していました。

ほとんどの参加者 (73.1%) はフッ化物についての知識がありました。彼らは一般に、それを水に含まれる「塩」または「ミネラル」と呼んでいました。さらに、7 人の参加者が、フッ化物が歯と骨格の健康を何気なく損なうと述べました。質問すると、ほとんど（90.4%）の参加者がフッ素症の症状の一部またはすべて、および健康上の問題とフッ素曝露との因果関係を正確に特定しました。参加者の大多数 (71.2%) は、フッ素症に罹患した人を少なくとも 1 人知っていました。

この知識は、フッ素曝露に対する対策をどのようにとるべきかについての理解の比較的欠如とは対照的であり、参加者の42.3%がフッ素症の予防方法が分からないと報告し、34.6%がフッ素症の治療方法が分からないと報告した。。注目すべきことに、参加者の約半数（48.1%）が、代替水源の使用と水処理がフッ素症を予防する方法であると正しく述べたが、フッ素症が医療と歯科治療によってのみ治療できることを理解している参加者は少なかった（26.9%）。フッ素症の予防と治療に関して最も多かった不正解は歯を磨くことでした。

参加者はフッ素を避ける努力をしていると報告したが、フッ素症は大きな懸念ではなかった。参加者の71.2%は、フッ素症を心配したことがないか、ほとんど心配していないと報告しました。フッ素症に対する予防策を講じていると報告した参加者 33 名 (63.5%) のうち、ほとんど (n = 27) が、汚染が知られていない水源の使用、ボーリング孔の水を雨水で希釈する、井戸の処理など、一般的に効果的な方法を使用していると報告しました。水を飲んでいる。しかし、5 人の参加者 (9.6%) は飲料水を沸騰させていると報告しましたが、これではフッ化物含有量は減りません。完全なアンケート回答は「データの利用可能性」にあります。

36 世帯からの合計 57 のサンプルを検査精度について分析しました (方法、表 2)。これらの水サンプルの大部分は、ボーリング孔 (49.1%)、雨水収集 (19.3%)、または保護された掘削井戸 (17.5%) から採取されました。提供されたサンプルの大部分 (84.2%) は調理、飲料、またはその両方に使用されましたが、フッ化物を減らすために処理されたサンプルはごくわずか (7.0%) でした。給水所は各家庭から遠く離れたところにはありませんでした。水を集めるのにかかる平均時間は往復で約 5 分でした。

参加者は、57 サンプル中 10 サンプルのみでフッ化物レベルの上昇を懸念していましたが、現場スタッフによる蛍光計分析では、45 サンプルでフッ化物レベルが 1.5 ppm 以上 (78.9%) であったことが示され、飲料水中に地生フッ化物が多く含まれていることを示しました (表 2 と図2a)。測定されたフッ化物レベルも高く、フッ化物濃度の平均値と中央値はそれぞれ 6.0 ppm と 5.8 ppm でした。 12 の非汚染サンプルのほとんどは雨水 (83.3%) でしたが、45 の汚染源のほとんどはボーリング孔 (53.3%)、保護された掘削井戸 (22.2%)、またはボーリング孔の水と混合した雨水 (11.1%) からのものでした (補足表 2) ）。

a 蛍光光度計で測定した、57 個の水サンプル中のフッ素濃度の分布。赤い破線は、1.5 ppm 以上のレベル上昇に対する WHO のガイドラインを示しています。 b 真陽性、偽陽性、真陰性、偽陰性の検査結果の代表的な画像。写真には、蛍光計で測定されたフッ化物濃度が注釈として付けられます。 c テスト結果の混同行列。「実際」とは、蛍光光度計による陽性（フッ化物 1.5 ppm 以上）または陰性（フッ化物 1.5 ppm 未満）としての分類を指します。「予測」とは、バイオセンサーテストのパフォーマンスを指します。「陰性」は色の変化が観察されなかったことを意味し、「陽性」は黄色が観察されたことを意味します。真陽性と真陰性は灰色で示され、偽陽性と偽陰性は白色で示されます。 d パネル c の分類から導出された受信機動作特性曲線。感度は (真陽性)/(真陽性 + 偽陰性) として計算され、特異度は (真陰性)/(真陰性 + 偽陽性) として計算されます。

研究参加者がバイオセンサー検査で再水和してから6時間後、現場スタッフは出力を、黄色が観察された場合はフッ化物陽性、色の変化が観察されなかった場合はフッ化物陰性と分類した。これらの観察結果と蛍光光度計の結果を比較することで、検査を真陽性 (黄色、測定されたフッ化物が 1.5 ppm 以上)、偽陽性 (黄色、測定されたフッ化物 <1.5 ppm)、真の陰性 (無色、測定されたフッ化物 <1.5 ppm) として分類することができました。、偽陰性 (無色、測定されたフッ化物 ≥ 1.5 ppm) (図 2b)。これらの結果を混同マトリックスに表にすると、バイオセンサーテストでは51サンプル（89.5％）が正しく分類され、6サンプル（10.5％）が誤って分類されたことが明らかになりました（図2c）。したがって、検査の感度は 93.3% (95% CI 81.7% ～ 98.6%)、特異度は 75.0% (95% CI 42.8% ～ 95.5%) でした。これらのデータを受信機動作曲線上にプロットすると、曲線下面積が 0.842 であることが明らかになりました (図 2d)。

私たちは、水源または処理の観点から、誤って分類された水サンプルの中にパターンを特定しませんでした。さらに、陽性対照反応のほぼ 5 分の 1 (n = 10、17.5%) が活性化に失敗したことが観察されました (補足表 2)。陽性対照が失敗したサンプル間に共通の特徴は観察されませんでした。さらに、一部の真陽性検査では対照に不合格があり、特定のサンプルの陽性対照の不合格が必ずしも検査による誤った分類と相関しているわけではないことが示されました。

使いやすさを評価するために、正確性（目的 1）のために水のサンプルを提供した 36 人の参加者に、水分補給の経験とテストの解釈について質問しました。参加者全員がマイクロピペットを使って水を PCR チューブにうまく移すことができましたが (図 3、左)、2 人のユーザー (5.6%) は水を分配するのに多少の困難を経験しました。現場の制約、特に現場スタッフが滞在している場所から参加者の家までの距離のため、現場スタッフはすべての参加者と物理的に一緒にいて、6 時間後のテスト結果を読むことができませんでした。反応が完了する前の色の変化でした (図 3、右)。しかし、読み出し時には、試験解釈の評価に使用された 57 個のサンプルのうち 1 個 (98.2%) を除くすべてで、黄色の有無の評価において、参加者と現場スタッフの間で一致が見られました (データの利用可能性)。社会人口学的特徴、フッ素症や家庭の水不足に関する経験や知識、態度、行動によって、使用感に差はありませんでした。

テストを操作するための 2 つの重要なユーザーアクティビティは、マイクロピペットを使用して水サンプルを微小管に移すテスト再水和 (左) と、ユーザーが黄色が現れたかどうかを確認する結果の解釈 (右) です。

私たちの知る限り、非専門家ユーザーによるバイオセンサーテストの現場展開と操作に関する最初の説明では、使用時点でのフッ化物バイオセンサーテストが多くの肯定的な特性を実証したことがわかりました。私たちの最初の目的では、現場条件下でのフッ化物の検出が正確であり、57 サンプルの 89.5% を正しく分類しました。感度は 93.3%、特異度は 75.0% で、受信機動作特性曲線の下の面積は 0.842 でした。これは、この検査が WHO の制限値 1.5 ppm 以上を超えるフッ化物汚染を正確に予測する確率が 84.2% であることを意味します。曲線下面積の値が 0.8 ～ 0.9 の場合、一般に「優れている」と考えられます26。

2 番目の目的として、これらのテストは非常に実用的でした。すべての参加者はテストに水分補給することができ、テストの解釈を評価するために使用された 57 個のサンプルのうち、研究スタッフと参加者の解釈の間に矛盾があったテストは 1 つだけでした。要約すると、参加者は自分の家庭用水源中の公衆衛生に関連するフッ化物濃度を正確に特定でき、この検査が非常に有用であることが示唆されました。

これらの検査は、実験室環境の外で飲料水のフッ化物含有量を確認するという満たされていない大きなニーズを満たします。ゴールドスタンダードの実験室手法であるイオンクロマトグラフィーやイオン感知電極と比較して、このバイオセンサーを使用すると、リソースを大量に消費するインフラストラクチャや訓練を受けた人員を必要とせずにフッ化物検査が可能になります。この研究で使用されたポータブル電極やフッ化物光度計などのゴールドスタンダードの使用時点でのテストと比較しても、バイオセンサーの動作モードはシンプルであり、テストされるサンプルあたりのコストは低くなります。実際、実験室規模で製造された検査あたり (陽性対照を含む) 0.73 米ドル (補足表 1) で、この方法は既存の技術と経済的に競争力があります。スケールアップによりコストをさらに削減できる可能性があります。

注目すべきことに、これらの検査では、参加者が予想していたよりもはるかに高いフッ化物レベルの上昇が蔓延していることが明らかになりました。これは、このような検査により、地生フッ化物の影響を受ける可能性のある他の地域でもフッ化物が明らかになる可能性があることを示唆しています。これらは、世界銀行、ギャラップ世論調査、米国国際開発庁が実施するような、人間の健康、福祉、水の安全に関する大規模調査にも役立つ可能性があります。また、フッ化物の除去措置が講じられた後に水の安全性を評価できるため、フッ化物の存在が十分に確立されている地域でも貴重である可能性があります。例えば、バイオセンサー検査では、フッ化物含有量を減らすために雨水で希釈した後であっても、ボーリング孔水のサンプル中に危険なフッ化物レベルが検出された。

最初のバッチのテストの劣化は、使用時点のバイオセンサーの精度が極端な温度への曝露による損傷を受けやすいことを明らかに浮き彫りにしました。大規模導入には、センサーの温度安定性を高めることにより、真のコールドチェーンの独立性を実現する必要があります。これは特に重要です。なぜなら、ケニア 25、インド 27、パキスタン 28、バングラデシュ 29 など、特有の地下水汚染が懸念される多くの地域は暑い気候だからです。温度安定性を向上させるための最も有望な手段の 1 つは、凍結乾燥時に系を安定化させるリオプロテクタントと呼ばれる化合物を添加することです。一部の in vitro 遺伝子発現反応では、適切な凍結乾燥保護剤を添加すると、50 °C で最長 1 か月間完全性を維持できますが、バイオセンシング反応では同様の研究は行われていません 30。したがって、温度安定性と保存期間を確保するために凍結乾燥プロセスを最適化することにより、センサーの堅牢性が大幅に向上し、最も必要とされる領域で正確な水質データが保証されます。

さらに、適切な対照反応を継続的に含めることは、テストの精度にとって重要です。制御反応は、テストの不合格を示すだけでなく、周囲温度の変化によって引き起こされる反応挙動の変化を制御するためにも重要です。温度の変化は検査の感度や特異性に影響を与えませんが、反応速度、つまり検出までの時間に影響を与えます。一部のサンプルに存在する可能性のある反応阻害剤による変動を制御できる校正アプローチの開発など、他のアプローチを使用して精度を向上させることもできます31。

これらのテストの使いやすさを向上させるための有望な方法がいくつかあります。まず、結果が得られるまでの時間が短縮されると、1 時間ごとにテストの色を見るよう求められる参加者にとって負担が軽減されます。他の設定で色の変化の曖昧さに関する問題が発生した場合は、代替の比色レポーターと基質 32 を使用して、より鮮やかな出力を生成することで解決できる可能性があります。さらに、凍結乾燥テストを再水和し、結果の解釈を容易にする専用ツールの開発により、ユーザーエクスペリエンスが大幅に向上します。たとえば、解釈をより明確にするために、家庭用妊娠検査で使用されるような側方流動アッセイ 33 で検査を具体化することもできます。将来の試験には、より多様な水源、特にセンサーの活性化に必要な生物学的プロセスを阻害する可能性のある酸性、アルカリ性、またはミネラルが豊富なサンプルでの試験の特性評価も含める必要があります。

要約すると、バイオセンサー検査で 1.5 ppm 以上のフッ化物で汚染された水を正確に識別できるということは、必要な機器、専門知識、インフラストラクチャ、運用コストがはるかに少なくて済む、水質診断への新しいアプローチの大きな可能性を示しています。実際、鉛 34、銅 35、亜硝酸塩 36、ヒ素 37 などの他の優先汚染物質を感知する生物学的メカニズムの最近の特徴付けは、これらすべての分析物に対して同様の使用時点テスト 38 が可能である可能性を示唆しています。これらのテストの精度、単純さ、迅速さ、比較的低コスト、および現場での使いやすさにより、広範な実施が促進され、それによって水の安全性に関する知識がすべての人に民主化されます。

この研究で使用したフッ化物バイオセンサーをコードする DNA プラスミドは、Gibson アセンブリ (New England Biolabs、カタログ番号 E2611S) を使用して組み立てられ、Qiagen QIAfilter Midiprep Kit (QIAGEN、カタログ番号 12143) を使用して精製されました。そのコード配列は、酵素カテコール 2,3-ジオキシゲナーゼの生成を制御するバチルスセレウス由来の crcB フッ化物リボスイッチで構成され、すべて構成的な大腸菌シグマ 70 コンセンサスプロモーター J2311939 の下で発現されます。使用したプラスミドの完全な配列は、Addgene でアクセッション番号 128810 (pJBL7025) [https://www.addgene.org/128810/] で入手できます。

試験で使用された無細胞バイオセンシング反応は、以前に確立されたプロトコルに従って設定されました20、40。簡単に説明すると、反応は、清澄な細胞抽出物、アミノ酸、緩衝塩、クラウディング剤、酵素基質、エネルギー源を含む試薬混合物、および鋳型 DNA とフッ化ナトリウムの反応特異的混合物で構成され、約 30/30/40 の割合で混合されます。比率（補足表 3）。試験反応にはフッ化ナトリウムが含まれていませんでしたが、陽性対照反応には遺伝子発現を誘導するために 1 mM フッ化ナトリウムが添加されました。両方の反応セットのテンプレート DNA 濃度は 5 nM で、フッ化物の非存在下で色の変化が観察されない最大テンプレート濃度によって決定されました。

反応のセットアップ中、細胞抽出物のマスターミックス、試薬ミックス、およびテンプレートミックスが、1.7 mL 微量遠心分離チューブ内のテスト反応とポジティブコントロール反応の両方のために調製されました。次に、個々の反応物を凍結乾燥用に PCR チューブストリップに 20 μL ずつ分注しました。氷上で等分した後、PCR チューブのキャップにピンで穴を開け、ストリップをアルミホイルで包み、次いで、包み込んだストリップを液体窒素に浸漬して約 3 分間凍結乾燥させました。反応液を直ちに、凝縮器温度 -84 °C、圧力 0.04 mbar の Labconco FreeZone 2.5 リットル -84 °C ベンチトップ凍結乾燥機 (カタログ番号 710201000) に移し、一晩 (16 時間以上) 凍結乾燥しました。

凍結乾燥後、テストは乾燥剤 (Dri-カード乾燥剤、Uline、カタログ番号 S-19582) (補足図 3)。真空シールされた反応液は、遮光性の外袋 (マイラーオープンエンドフードバッグ、Uline、カタログ番号 S-11661) に入れられ、出荷前にインパルスヒートシール (Metronic 8 インチインパルスバッグシーラー、Amazon、ASIN B06XC76JVZ) されました。。テストには、現場での操作のために使い捨て 20 µL マイクロピペット (MICROSAFE® 20 µL、Safe-Tec LLC、カタログ番号 1020) も同梱されていました。

バイオセンサーテストの最初の出荷は、調査対象となった最初の 16 世帯からの 33 個の水サンプルを評価するために使用されました。これらのテストはすべて、水源や蛍光光度計で確認されたフッ化物濃度に関係なく、淡い黄色を示しました。これは、民間輸送機関による輸送中のテストの熱劣化が原因である可能性があります。以前の研究では、最長 1 年間の保存安定性が報告されています 20,41 が、これらの数値は、温度管理された実験室条件での保管から得られたものです。米国イリノイ州からケニアのナイロビまでの商用輸送ルートは、非常に暑い地域、たとえばこの特定の輸送ではドバイを通過します。これらの条件は、より穏やかな輸送条件と保管条件でテストが商用航空で輸送されたコスタリカでの以前の研究ユーザビリティ調査とは大きく異なりました20。試験温度の安定性を実験室で調査したところ、保管温度の上昇により実際に試験成分が劣化し、現場観察と一致して再水和時に淡い黄色になる可能性があることが示されました（補足図2）。

したがって、テストの次のバッチは 2022 年 1 月 25 日に冷蔵で出荷されました。これにより、以前の結果と一致するようにテストの保存安定性が延長されるという仮説が立てられました。テストを作成して梱包した後、それらをポリスチレンフォームで裏打ちされた容器に入れてから、NanoCool 冷却システム (Peli BioThermal) で覆いました。その後、コンテナを密閉して、標準的な商業輸送サービスを使用して出荷しました。この一連のテストは、2022 年 2 月 28 日のリリースまで税関で冷蔵保管されていました。これらのテストは、この原稿で報告されるテスト精度に関するデータを生成するために、2022 年 3 月 5 日から 3 月 14 日まで現場で使用されました。

熱劣化による変色は、フッ化物の存在下で意図した黄色の色合いを混乱させる可能性があるため（つまり、偽陽性）、出荷および参加者の自宅への輸送中に冷蔵されたテストのみを使用してテストの精度を評価しました。したがって、最初の 16 世帯からの 33 個の水サンプルは、検査精度の分析から除外されました。

参加者は、ナクル郡内のバルト区にある6つのサブロケーション（ケレルウェット、キプシンボル、キゴノール、パークビュー、ラルウェット、ムワリキ）から募集されました（補足図4、OpenStreetMap42から適応された地理情報）。この場所は、フッ化物レベルが高く、調査チームが地域社会に精通しているため選ばれました。

データが収集される前に、研究の目標と目的について話し合うために、各サブロケーションでコミュニティ会議が開催されました。調査を実施するためにコミュニティと村の次長から許可を得た後、地元コミュニティの動員員が参加資格のある世帯の特定を支援するために従事しました。 18 歳以上で、ナクル国に 3 か月以上居住し、飲料水として地元の水源に依存しており、家庭に子供がいて、家庭の水の状況について喜んで話し、各水源のサンプルを提供する個人家庭の水のうちフッ素検査の対象となった。さまざまな社会人口学的特徴と飲料水源を確保するために、5 つのサブロケーションのそれぞれから 10 ～ 12 人の参加者を募集しました。小児のフッ素症に関する地域社会の理解を明確にするためには、小児の居住者がいることが基準でした。

書面によるインフォームドコンセントを得た後、参加者は 30 分間の調査に参加しました (データ収集のグラフの概要については補足図 1 を参照)。トピックには、世帯の社会人口学的情報、フッ化物とフッ素症に関する知識、態度、行動、および検証済みの家庭の水不安経験 (HWISE) スケールを使用した家庭の水不安が含まれます43。 HWISE の 12 項目は、前月に水の不安を経験した頻度を尋ねます。 0 ～ 36 の範囲では、「決して」は 0 点、「頻繁に/常に」は 3 点となります。これらのデータは、フッ素症や水不足の経験によって、検査に対するユーザーの経験や態度が変化するかどうかを調査できるように収集されました。参加者には、水源の数と、水サンプルを提供して検査する意欲についても質問されました。調査回答は、Open Data Kit (ODK)44 を使用してタブレットに記録されました。

調査完了後、参加者はさまざまな家庭用水源からの水のサンプルを 1 ～ 3 つ提供しました。その後、彼らは検査プロセスの簡単な説明（約 5 分）を受け、フッ素バイオセンサー検査を使用して自分の家庭サンプルを検査しました。各テストは、陽性対照となるマイクロチューブと、目的のサンプルをテストする 2 番目のマイクロチューブで構成されていました。サンプルをテストするために、参加者はまず遮光ホイルポーチと乾燥剤が入った真空密封ポーチからテストを取り出し、その後、両方とも廃棄しました（補足図3）。次に、マイクロピペットを充填ラインまでゆっくりと浸して 20 µL の水を充填しました。水を分配するには、親指と人差し指を使ってマイクロピペットの穴を覆い、もう一方の手で球根を絞りました。次いで、反応物を周囲温度で最大 6 時間インキュベートしましたが、目に見える色の変化があった場合はさらに短くなりました。この潜伏期間中、参加者は黄色の変化を1時間ごとにチェックし、それが起こるまでに要した時間を記録するよう求められました。フッ化物レベルが 1.5 ppm 以上の場合、テストは黄色に変わると予想され、このレベル未満の水のテストでは色の変化はありませんでした。すべての陽性対照は黄色に変わると予想されました。視覚的なコントラストを得るために反応液を白い背景に置いた後、色の変化を読みました。

研究チームは再び、テストプロセスに関するユーザーエクスペリエンスに関する2回目の調査を実施し、ゴールドスタンダード光度計を使用して6時間以内に水サンプルをテストしました。参加者は、テスト手順の経験と、サンプルテストとコントロールテストの結果の色の解釈について質問されました。完了した反応の写真もこの時点で撮影されました。最後に、現場チームが Hanna Instruments フッ素高範囲光度計キット (カタログ番号 HI97739C) を使用してフッ素の定量測定を行いました。これは、生物工学検査の精度を評価するために使用される代表的な方法です。実際に測定された水サンプルのフッ化物濃度に関する測光結果は参加者と共有され、説明されました。 2 回目の調査の終了時に、各参加者には調査に参加した時間と労力に対する報酬として KES 500 (USD 4.30) が与えられました。参加した各世帯にはセラミック製の飲料水フィルターも与えられました。

データは、2021年11月16日から11月23日までと2022年3月5日から3月14日まで収集されました。測量と水質検査中、参加者と研究助手は地域のガイドラインに従って新型コロナウイルス感染症プロトコルを維持しました。研究スタッフはワクチン接種を受け、適切な社会的距離を維持し、手を消毒し、各家庭訪問後に現場用具を洗浄した。

データは分析のために ODK から Microsoft Excel にエクスポートされました。参加者の色の変化の解釈が研究スタッフの解釈と一致するかどうかなど、参加者の社会人口統計とユーザビリティの経験を記述するために、基本的な記述統計が実行されました。フッ素とフッ素症の知識、態度、行動に関する自由回答項目はテーマごとにグループ化され、2 人の著者によって個別にコード化されました。知識関連の反応は、従来の生物医学的理解と一致する場合は「正しい」、そうでない場合は「不正確」であると特徴付けられました。

ケニアを拠点とするフィールドチームによって、テストは6時間後に目に見えて黄色になった場合は「オン」、目で観察できる色の変化がなかった場合は「オフ」に分類されました。これらの評価は、米国に拠点を置くチームによって、完了したテストの写真から独立して検証されました。「ON」として分類された検査は、光度計で測定されたフッ化物濃度が 1.5 ppm 以上に相当する場合は真陽性とマークされ、光度計で測定されたフッ化物濃度が 1.5 ppm 未満に相当する場合は偽陽性とマークされました。「オフ」として分類された検査は、光度計で測定されたフッ化物濃度が 1.5 ppm 未満に相当する場合は真陰性としてマークされ、光度計で測定されたフッ化物濃度が 1.5 ppm 以上に相当する場合は偽陽性としてマークされました。感度は、全陽性測定値（真陽性と偽陽性の合計）に対する真陽性結果の比率によって決定され、特異度は、全陰性測定値（真陰性と偽陰性の合計）に対する真陰性結果の比率によって決定されました。 Stata45で計算されます。感度と特異度の信頼区間は、Stata の diagt モジュールを使用し、真陽性、真陰性、偽陽性、および偽陰性の数を使用して計算されました。

検査精度 (目的 1) を確立するための目標サンプルサイズは、観察された感度 0.93、観察された有病率 0.7846 に基づいて 65 でした。 90 個の水サンプルを入手しましたが、この分析に適したのは 57 個だけでした (「ケニアのナクル郡へのテストキットの発送」を参照)。このサンプルサイズでも確実な推定値が生成されました。ユーザビリティテスト (目的 2) の場合、36 名からの水分補給と通訳の経験に関するデータは、ユーザビリティの研究に推奨される数をはるかに上回っています 47,48。

我々は、ノースウェスタン大学 (IRB STU00215306) および Amref Health (AMREF-ESRC P1003/2021) の治験審査委員会からこの研究の倫理的承認を得ました。また、ナクル郡計画開発省からも認可を受けました。同省は、郡内および関連省庁の研究活動の調整を担当しています。すべての参加者は、自宅での検査の写真を撮ることへの同意を含め、研究活動に参加することについて書面による同意を提出しました。著者らは、人間の研究参加者が図 3 の画像の公開についてインフォームドコンセントを提供したことを確認しています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

主要な数値と SI 数値のすべてのソースデータは、ノースウェスタンの Arch データベース (https://arch.library.northwestern.edu) にオープンアクセスで保管されました。データには https://doi.org/10.21985/n2-zyy5-cp15 からアクセスできます。使用したプラスミドの完全な配列は、Addgene でアクセッション番号 128810 (pJBL7025) [https://www.addgene.org/128810/] で入手できます。

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何よりもまず、私たちを自宅に迎え、水の不安や水質検査の経験を共有してくれたすべての研究参加者に心から感謝します。データ収集にご協力いただいたジャネット・バルソライ・チェプチルチル氏とマックスウェル・オティエノ・アドゥオゴ氏、そして地域活動への協力をいただいたジェームス・イェゴン氏（SOAR-ケニア・アカデミー）に感謝します。また、米国からケニアへの反応物の輸送を管理してくださったシャーロット・クノップ氏（ノースウェスタン大学）にも感謝したいと思います。センサーの温度安定性に関する有益な洞察と、この研究で使用したいくつかの試薬を提供してくれた Dylan Brown (Northwestern University) に感謝します。また、統計分析に関するアドバイスをくれた Hilary Bethancourt (Northwestern University) に感謝します。この研究はカーネギー社の支援を受けました。ノースウェスタン大学の政策研究所とユダヤ人およびイスラエル研究のためのクラウン・ファミリー・センター。米国国際開発庁協力協定 AID-OAA-L-14-00006 を通じてフィード・ザ・フューチャー持続可能強化イノベーション研究所に提供されたアメリカ国民の支援。および米国陸軍契約コマンド W52P1J-21-9-3023。

Walter Thavarajah、Patrick Mbullo Owuor などの著者も同様に貢献しました。

ノースウェスタン大学化学生物工学部、2145 Sheridan Road、Evanston、IL、60208、USA

ウォルター・タヴァラジャ & ジュリアス・B・ラックス

合成生物学センター、ノースウェスタン大学、2145 Sheridan Road、Evanston、IL、60208、米国

ウォルター・タヴァラジャ、ジュリアス・B・ラックス、サラ・L・ヤング

ノースウェスタン大学水研究センター、2145 Sheridan Road、Evanston、IL、60208、米国

ウォルター・タヴァラジャ、ジュリアス・B・ラックス、サラ・L・ヤング

Center for Engineering, Sustainability and Resilience、Northwestern University、2145 Sheridan Road、Evanston、IL、60208、USA

ウォルター・タヴァラジャ、ジュリアス・B・ラックス、サラ・L・ヤング

ノースウェスタン大学人類学部、1810 Hinman Avenue、Evanston、IL、60208、米国

パトリック・ムブッロ・オウール、ラーフル・アガーワル、サラ・L・ヤング

ノースウェスタン大学政策研究所、2040 Sheridan Road、Evanston、IL、60208、米国

パトリック・ムブッロ・オウール

アフリカ研究プログラム、ノースウェスタン大学、620 Library Pl、Evanston、IL、60208、米国

パトリック・M・ヤング＆サラ・L・ヤング

ナイロビ大学経営科学およびプロジェクト計画学部、私書箱 30197、GPO、ナイロビ、ケニア

ダイアナ・ロス・アウォール

モイ大学公衆衛生学部疫学・医療統計学部、私書箱 4606-30100、エルドレット、ケニア

カールマックス・キプロティッチ

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概念化、WT、PMO、JBL、SLY。データキュレーション、PMO、DA、KK、RA; 正式な分析、WT および RA; 調査、PMO、DA、KK; 方法論、WT、PMO、DA、KK、JBL、SLY; プロジェクト管理、WT、PMO、JBL、SLY。 JBLとSLYの資金調達。執筆 - 原案、WT、PMO、RA、JBL、SLY。執筆 - レビューと編集、WT、PMO、DA、KK、RA、JBL、SLY

ジュリアス・B・ラックスまたはセラ・L・ヤングへの通信。

著者らは、以下の競合する金銭的利益を宣言します。 WT と JBL は、この研究に含まれる技術的に重要な開発に関する特許 (国際公開番号 WO 2020/185451 A3) を保有しています。 JBL は Stemloop, Inc. の共同創設者です。JBL の利益は、利益相反ポリシーに従ってノースウェスタン大学によって検討および管理されます。

我々は、高所得国の研究者と低・中所得国の研究者間の協力において潜在的な不公平があることを認識しており、研究結果の設計、実施、分析、普及を通じて包括性に留意した。私たちは、人を対象とした研究に関するケニアの国および地方のすべての規則、および米国の機関の規則に従いました。米国とケニアに拠点を置く科学者の両方が、研究計画、データ収集手段の作成、データの解釈に参加し、この論文の共著者としても参加しました。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Thavarajah、W.、Owuor、PM、Awuor、DR 他。ケニアの田舎におけるユースポイントフッ素バイオセンサーの精度と使いやすさ。 npj クリーンウォーター 6、5 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41545-023-00221-5

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受信日: 2022 年 7 月 8 日

受理日: 2023 年 1 月 23 日

公開日: 2023 年 2 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41545-023-00221-5

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npj クリーンウォーター (2023)

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