Th17 応答と天然 IgM 抗体は、全身性エリテマトーデス患者の腸内細菌叢の組成に関連しています

Scientific Reports volume 6、記事番号: 24072 (2016) この記事を引用

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ファーミクテス/バクテロイデス比の低下を特徴とする腸内細菌叢異常が、全身性エリテマトーデス（SLE）患者で報告されています。 この研究では、SLE患者の便サンプルから分離された微生物叢（SLE-M）が、健康な対照微生物叢よりもリンパ球の活性化とナイーブCD4+リンパ球からのTh17分化を促進することが、インビトロ培養により明らかになった。 SLE-M に Treg 誘導細菌を濃縮すると、2 つのクロストリジウム菌株の混合物が Th17/Th1 バランスを大幅に低下させる一方、ビフィズス菌ビフィダムの補給により CD4+ リンパ球の過剰活性化が防止されることが示されたため、Treg 誘導菌株を含むプロバイオティクスの治療効果の可能性が裏付けられます。 SLEに存在するTreg/Th17/Th1の不均衡を回復するため。 実際、患者サンプルの ex vivo 分析では、Th17 および Foxp3+ IL-17+ 集団の拡大が示され、Treg-Th17 の分化転換の可能性が示唆されました。 さらに、糞便微生物叢の分析により、健常対照者ではIL-17+集団とファーミクテス属の間の負の相関関係が明らかになったが、SLEではこの門が患者でわずかに減少したTh1サイトカインであるIFNγの血清レベルと直接相関していた。 最後に、シナジステテスの頻度は、健康な対照におけるファーミクテス/バクテロイデス比と正の相関があったが、抗dsDNA力価が上昇すると患者では減少する傾向があり、IL-6血清レベルと強い負の相関を示し、天然防御力と正の相関を示した。ホスホリルコリンに対する IgM 抗体。

全身性エリテマトーデス (SLE) は、環境要因と遺伝的要因の組み合わせによって引き起こされ、自己抗原に対する耐性の低下を引き起こす慢性自己免疫疾患です1。 その後の自己反応性 B 細胞による自己抗体の産生は、組織損傷を引き起こす免疫複合体の形成と沈着を引き起こすため、SLE の重要な病理学的要因を構成します 2。 同様に、このような自己抗原の認識によって活性化されたナイーブ CD4+ 細胞は、局所環境に存在するサイトカインのパターンに基づいていくつかのサブセットに区別できます 3。 Th1/Th2 細胞免疫応答のよく知られたパラダイムに加えて、今日では多くの証拠が SLE 疾患における Th17 細胞および制御性 T (Treg) 細胞の変化の存在を明らかにしています 4,5,6。 Th17 細胞に関しては、IL-17、IL-22、IL-237 などの局所炎症および組織破壊に関与する炎症促進性サイトカインの分泌を介して、SLE における自己免疫応答の主要な推進者として重要な役割を果たしていることがいくつかの研究で支持されています。 したがって、最近、SLE9、10、11においてIL-17およびIL-17産生T細胞の循環レベルの増加が報告されています。 さらに、IL-17 産生 T 細胞は狼瘡患者の肺、皮膚、腎臓に浸潤し、臓器損傷の一因となることも示されています 10,12。 逆に、Treg 細胞は異常なエフェクター応答に対して抑制活性を示すため、自己免疫疾患や炎症性疾患の予防に不可欠です 13。 天然に存在する Treg 細胞は胸腺から出現し、主に高レベルの CD25 (IL2Rα 鎖) と Treg 細胞の発生と機能に必要な転写因子 FOXP3 の存在を特徴としています 14。 さらに、Treg 細胞は、多様な抗原に応答して末梢組織で増殖または誘導される可能性があります 15。 ほとんどの研究では、SLE 患者における循環 Treg 細胞の数の減少または機能障害が報告されています 16、17、18。

腸に定着する共生微生物叢の組成が腸関連リンパ組織 (GALT) に存在する免疫細胞の分化に影響を与えることを示唆する証拠が増えています 19。 具体的には、固有層の形質細胞は、天然 IgM 抗体と呼ばれる、共生細菌と病原性細菌の両方の成分、およびアポトーシス細胞に対する T 細胞非依存性抗体の産生に関与しています 20。 興味深いことに、いくつかの研究で、自然免疫細胞の炎症シグナル伝達を阻害し、自己免疫疾患を抑制する天然 IgM 抗体の免疫調節機能が報告されています 21,22。 一方、細菌抗原の認識後、腸樹状細胞 (DC) は、ナイーブ CD4+ T 細胞の異なる種類のエフェクターまたは制御性 T 細胞への分化を誘導する可能性があります 23、24、25、26。 生理学的条件下では、健康な人に存在する正常な微生物叢は、腸管免疫恒常性の維持に有利に働きます27。 逆に、いくつかの研究は、腸内細菌叢組成の変化（腸内微生物叢異常として知られる）が、おそらく病気になりやすい宿主において、Th 細胞と Treg 細胞の間の不均衡の生成を通じて、数多くの免疫介在性病状の発症における重要な因子である可能性があることを示唆しています19 、28、29、30、31。 この意味で、腸内毒素症は、炎症性腸疾患、1 型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症などのいくつかの自己免疫疾患の発症と関連しています 32、33、34、35、36、37、38。 これに関連して、我々は最近、ヒト腸内で最も豊富に存在する門であるファーミクテス属対バクテロイデス属の比が著しく低いことを特徴とするSLE関連の腸内細菌叢異常について報告した39。これは、他の疾患において不均衡が生じていると以前に報告されている37、38、40。 これらの研究は、微生物叢が腸の外側の Th/Treg 軸を制御できることを示唆しているため、特定の細菌による免疫刺激は炎症性疾患に有益な効果をもたらす可能性があります 33。 したがって、一部の細菌株はナイーブ前駆体から Treg 細胞 (iTreg) の生成を誘導する可能性があることが知られています 23、41、42、43。 具体的には、ビフィズス菌とクロストリジウム属の共生菌株の役割を裏付ける証拠が蓄積されています。 Treg細胞の誘導においてクラスターIVおよびXIVaに属する23、41、42、43。

この研究の目的は、SLE患者および健常対照者から得られた糞便微生物叢がThおよびTreg集団のin vitro分化に及ぼす影響と、Treg細胞の誘導因子であることが知られているビフィズス菌およびクロストリジウム菌株をSLE腸内微生物叢に濃縮することの考えられる影響を評価することである。 。 次に、SLEに関連する腸内細菌叢の異常と、Treg/Th集団、サイトカインレベル、疾患活動性、病原性抗dsDNAと防御的天然物質の両方の産生など、これらの患者に特徴的な免疫パラメーターの存在との間の考えられる関係を分析しました。 IgM 抗ホスホリルコリン抗体。

SLE 患者で最近報告された腸内細菌叢 39 を考慮して、我々は、制御性 T 細胞 (Treg) の in vitro 分化における SLE 患者 (SLE-M) および健康な対照 (HC-M) から得られた糞便微生物叢の影響を評価することを目的としました。ナイーブ CD4+ T リンパ球からの Th1 および Th17 エフェクター集団も同様です。 さらに、Treg サブセットを増加させることができる菌株で腸内細菌叢を強化する効果を評価するために、SLE-M の 5、10、または 30% を同量のビフィドバクテリウム ビフィダム LMG13195 (Bb)、つまり、Treg サブセットを増加させることが知られている菌株で置き換えました。 Foxp3 発現 23,41、または推定上の Treg 誘導効果を持つ 2 つのクロストリジウム菌株 (Cl) の混合物 (Ruminococcus obeum DSM25238 および Blautia coccoides DSM935)42,43。 したがって、未熟単球由来の DC を、成熟対照として LPS、またはさまざまな細菌調製物で 48 時間処理し、その後 CD4+CD45RA+ ナイーブ T リンパ球のプライミングに使用しました。 IL-2の存在下で12日間培養した後、CD4+リンパ球におけるTreg(CD4+CD25highCD127lowFoxp3+)、Th17およびTh1(それぞれIFNγ発現細胞およびIL-17発現細胞)集団をフローサイトメトリーによって測定した。

予想どおり、IL-2 による刺激と増殖により、ほとんどの CD4+ リンパ球で IL-2Rα (CD25) 発現が誘導されました (図 1A)。しかし、CD25 レベルの上昇 (CD25high) を示す細胞の量は、治療間で差異が示されました (図 1B)。 具体的には、SLE-M培養物はHC-Mより多くのCD25high細胞を生成する傾向があったが、この集団の最低レベルはBb株による刺激後に得られた。 実際、CD25 発現に対する SLE-M の上方制御効果は、Bb 補給後に元に戻りました。 Treg 細胞 (CD4+CD25high CD127lowFoxp3+) に関しては、HC-M 刺激と SLE-M 刺激の間に有意差は観察されませんでした。 しかし、CD25high 集団に含まれる Foxp3+ 細胞の割合は、HC-M 由来培養物よりも SLE- の方が低かったため (図 1C)、SLE-M の存在下で生成された CD25high 細胞の一部はむしろ活性化リンパ球であったことが示唆されます。 Treg細胞よりも。 予想外なことに、Bb は Foxp3+ 細胞を顕著に増加させましたが、この株を SLE-M に補給しても、CD25high サブセット内の Foxp3+ 細胞の生成は増加しませんでした。

ナイーブ CD4+CD45RA+ リンパ球を、LPS (成熟コントロール) で事前に成熟させた DC、健康なコントロール (HC-M) または SLE 患者 (SLE-M) から分離した糞便微生物叢、およびビフィドバクテリウム ビフィダム LMG13195 ( Bb)、クロストリジウム菌株 (Cl)、または 5、10、または 30% の Bb または Cl を含む SLE-M。 培養された CD4+ T 細胞を回収し、Treg マーカー、IL-17 および IFNγ について染色し、フローサイトメトリーで分析しました。 (A) Treg 細胞 (CD4+CD25highCD127lowFoxp3+) を識別するために使用される逐次ゲーティング戦略。 各マーカーの陽性細胞は、陰性対照として、対応するアイソタイプが一致した結合型無関係な MAb で標識された細胞の蛍光を使用して決定されました。 最も高い CD25 発現を示す CD4+ T 細胞は、CD4+CD25high として同定されました。 次に、CD25high 集団を分析して、Foxp3 を発現する細胞 (CD25high 内の Foxp3+) の割合および Treg 細胞 (CD25highCD127lowFoxp3+) の量を決定しました。 密度プロットは代表的な実験に対応します。 (B) CD25high 集団、(C) CD25high 集団内の Foxp3+ 細胞、および (C) IL-17/IFNγ 発現の分析。 棒は、異なる献血者を用いて行われた7回の独立した実験の平均値とSEMを表します。 SLE-M とさまざまな治療の間の統計的差異は、一対のデータに対する Wilcoxon 検定によって評価されました。 *p < 0.1; **p < 0.05。

最後に、両方の糞便微生物叢で処理した細胞間で IL-17 または IFNγ 発現に有意差は検出されませんでしたが、IL-17/IFNγ 比は HC-M 培養物よりも SLE 培養物で有意に高かったのに対し、最も低い比は、 Cl条件付けされたDC。 さらに、SLE-MにClを補給すると、IL-17/IFNγバランスの有意な用量依存性低下が誘導されたが、Bbは誘導されなかった（図1D）。 したがって、SLE-MによるナイーブCD4+ T細胞のin vitro刺激は、HC-M治療よりも大幅にリンパ球活性化とTh17分化を促進し、したがってSLEにおけるTh17/Treg障害をサポートすると思われる。 さらに、Bb による SLE 微生物叢の強化はリンパ球の活性化を防ぐ可能性があり、一方、Cl の補給は Th17/Th1 バランスを回復します。

SLE-Mによってin vitroで誘発されたTreg/Th応答がSLE患者の特徴的な免疫特徴を反映しているかどうかを知るために、我々は新鮮な末梢血CD4+リンパ球および血清におけるFoxp3、CD25、CD127、IL-17およびIFNγの発現を分析した。 37 人の SLE 患者と 36 人の HC 患者における一連のサイトカインのレベル (表 1)。 さらに、これらの個人のうち 40 人（SLE 20 人および HC 20 人）は、以前に糞便微生物叢のメタゲノム研究に含まれていたため 39（表 2）、これらの免疫パラメーターと SLE 関連の腸内細菌叢の異常との間の可能性のある関係を決定しました。

結果は、HCと比較してSLE患者、特に抗dsDNA抗体を提示する患者ではTh17細胞の頻度が増加していることを示しましたが、Th1サブセットでは有意差は観察されませんでした（図2A）。 さらに、Foxp3+ IL-17+ 二重陽性細胞は、HC と比較して SLE 患者で有意に増加しており、抗 dsDNA 抗体を提示する患者ではそのような細胞の最高レベルが再び観察されました (図 2B)。 Treg 細胞 (CD4+ CD25high CD127lowFoxp3+) の割合には有意差は検出されず、SLE 患者では Treg-Th17 分化転換プロセスが調節活性を伴わない Foxp3+ 細胞の発生に関与している可能性があることが示唆されました。

Foxp3、CD25、CD127、IL-17、および IFNγ の発現を、SLE 患者および HC からの新鮮末梢血 CD4+ リンパ球で分析しました。 (A) ドットプロットは、陰性対照として対応するアイソタイプが一致した結合型無関係な MAb で標識された細胞の蛍光に基づいて決定された、IL-17 または IFNγ 発現陽性の細胞を示します。 散布図は、抗 dsDNA 抗体 (aDNA) を提示する (pos) または提示しない (neg) HC および SLE 患者における IL-17+ (Th17) および IFNγ+ (Th1) CD4+ 細胞の割合を表します。 横棒は中央値を示します。 (B) Treg 細胞は、CD4+CD25highCD127lowFoxp3+ 細胞として順次同定されました。 散布図は、HC および SLE 患者の抗 dsDNA 状態に応じた Treg、Foxp3+ IL-17+、および Foxp3+ IFNγ+ 細胞の量を表し、水平バーは中央値を示します。 グループ間の統計的差異はクラスカル-ウォリス検定によって評価され、ダンの事後検定を実行してどのグループのペアの平均値が異なるかを決定しました。 **p < 0.01; ***p < 0.001。

一方、HC グループの糞便微生物叢の分析では、ファーミクテス属の頻度と Th17 サブセットのサイズとの間に負の相関関係があり、特に Foxp3+ IL-17+ 細胞で負の相関関係が見られたのに対し、バクテロイデス属では逆の相関が見られました (表 3)。 ); これらすべての相関関係は、体重、BMI、血中脂質で調整された多変量線形回帰分析によって確認されました (*p < 0.05、R2 > 0.6)。 しかし、そのような関連性は患者には全く見られず、これは我々が以前に記載したSLEにおけるファーミクテス/バクテロイデス比の減少と一致する。

サイトカイン血清レベルに関しては、SLE患者はIL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFNα、TNFα、GM-CSF、BLySおよびレプチンの量が多かった。一方、IFNγは明らかな減少傾向を示しました（図3A）。 興味深いことに、SLEにおけるサイトカインの増加または変化はいずれもファーミクテスまたはバクテロイデスとの有意な関連を示さなかったが、IFNγレベルはバクテロイデスと負の相関を示し、患者のファーミクテスおよびファーミクテス/バクテロイデス比と正の相関を示した（図3B）。 これらの関連性は HC では検出されませんでした。

(A) ボックスとひげは、対照と比較した SLE 患者におけるサイトカインの循環量の中央値および四分位範囲を表します。 両グループ間の差異は、ノンパラメトリック マン-ホイットニー U 検定によって評価されました。 (B) SLE 患者における IFNγ の血清レベルとファーミクテス属、バクテロイデス属の頻度、またはファーミクテス属とバクテロイデス属の比 (F/B) の間の相関関係を、スピアマン テストを使用して評価しました。

以前に報告したように 39、糞便相乗効果の割合は、SLE 患者と健康な対照の間で有意な差を示さなかった。 ただし、この細菌グループと抗 dsDNA 抗体の力価との間に負の相関傾向が見つかりました (r = −0.386、p = 0.084)。これまでに分析された他の微生物グループでは検出されませんでした。 同様に、IL-6 の血清レベルは、SLE 患者における Synergistetes の量と負の相関があり (r = −0.738、p < 0.001)、このことから、この細菌群と疾患活動性または抗体産生との間に関係がある可能性が示唆されています。 したがって、体液性免疫応答の発生において腸内協力者が果たす可能性のある役割についての知識を拡大することを目的として、抗 PC IgM、天然防御抗体、および抗 PC IgG (この効果がない) の血清レベルを定量した。総循環 IgM および IgG。 患者と対照の間で抗 PC 抗体 (IgM および IgG) および総 IgM に有意差は検出されませんでしたが、総 IgG 量は対照と比較して患者で増加していました (p = 0.027)。 興味深いことに、抗 dsDNA 力価は、アイソタイプ抗 PC 抗体 (IgM: r = −0.508、p = 0.019; IgG: r = −0.460、p = 0.036) および総 IgM (r = −0.501、p = 0.036) の両方と負の相関がありました。 0.021) ではあるが、IgG (r = 0.065、p = 0.780) レベルではないことから、天然に存在する防御 IgM 抗体に対する SLE 疾患活動性の悪影響が示唆されます。

一方、Synergistetes は、SLE 患者の総 IgM および抗 PC IgM、および患者および対照の総および抗 PC IgM/IgG 比と正の相関を示しました (表 4)。 興味深いことに、患者の血清 IL-6 レベルは逆の関連性を示しました。 これらすべての結果は、腸内共力成分が防御的な天然 IgM 抗体の発達を促進する可能性があることを示唆しています。これは、抗 dsDNA および/または IL-6 のレベルの上昇によりこの細菌群がダウンレギュレートされる可能性があるため、特に SLE 患者に関連する効果です。

最後に、シネルジステテスは対照ではバクテロイデスと負の相関（r = −0.486、p = 0.022）、ファーミクテス/バクテロイデスの比（r = 0.443、p = 0.039）と正の相関を示しましたが、SLE患者ではそうではなかった（r = 0.075）ことは注目に値します。 、p = 0.745およびr = −0.136、p = 0.556）、SLEにおけるこれらの細菌群の役割を裏付けています。

腸内細菌叢の異常は、SLE39 やその他の自己免疫状態を含むいくつかの免疫介在性疾患と関連しており 32,33,34,35,36,37,38、腸内細菌叢の炎症反応と調節反応のバランスにおけるマイクロバイオームの役割の可能性を指摘しています。腸または全身的に。 したがって、腸内微生物叢が免疫応答をどのように形成するかを理解することは、人間の健康、特に自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患にとって重要であると考えられます。 しかし、我々の知る限り、これはエフェクターまたは制御性 T 細胞応答の誘導に対する SLE 便サンプルから分離された腸内微生物叢の影響を評価した最初の研究です。

我々の発見により、SLE患者とHCの間の糞便微生物叢の組成の違いが、異なるin vitro免疫応答を誘発することが明らかになりました。 具体的には、SLE-Mで刺激されたDCは、HC-Mで条件付けされたDCよりも、ナイーブCD4+ Tリンパ球からのTh17分化を大幅に促進した。 Treg 細胞の生成には差異は検出されませんでしたが、SLE-M 処理で得られた拡大した CD25high 集団には、Foxp3+ 細胞の割合が低い傾向があり、それらの細胞が調節状態ではなく活性化状態であることを裏付けています。 したがって、変化した SLE 腸内微生物叢はリンパ球の活性化と Th17 の分化を促進し、それによって既存の炎症を持続させる可能性があります。

これらの所見は、エクスビボ分析の結果と一致している。なぜなら、Th17細胞の頻度は、HCと比較して、SLE患者からの新鮮な末梢血において、特に抗dsDNA抗体を提示する患者において増加したが、Treg細胞においては差異が観察されなかったためである。 。 興味深いことに、SLE 患者では IL-17 を産生する Foxp3+ 細胞の割合が高かったため、SLE 患者で報告されている Treg 細胞の調節活性の低下の原因である可能性のある Treg-Th17 の分化転換プロセスが示唆されています 18。 同様に、炎症性腸疾患患者では、循環している IL-17 と Foxp3 を二重発現する CD4+ リンパ球の有病率の増加と、Treg サプレッサー能力の低下が見出されています 44。 他の臓器と比較して腸内に存在する Treg 細胞の頻度が高い 45 ことは注目に値しますが、それらは Treg/Th 可塑性が増加しており、炎症性メディエーター、特定の細菌株、その他の微小環境因子の影響を受ける可能性があります 46。 これと一致して、糞便微生物叢の分析により、IL-17+ Foxp3+ のサイズと、より小規模ではあるが Th17 の集団と健康な対照におけるファーミキューテスの頻度との間に強い負の相関関係が明らかになり、それらが Th17 の分化を妨げる可能性があることが示唆された。 一方、原型のTh1サイトカインであり、SLEではわずかに低下しているIFNγの血清レベルは、患者においてファーミクテス菌の量およびファーミクテス菌対バクテロイデテス菌の比と直接相関しており、この不均衡はSLE腸内毒素症の主な特徴であり、疾患とは無関係である。期間、ライフスタイル、食事関連要因39. したがって、我々は、ファーミクテス門に属する細菌株が腸内での機能的なTreg細胞の生成および/または維持に関与し、生理学的条件下でのエフェクターTh17細胞への分化転換を回避している可能性があるが、これらの細菌の割合は減少しているのではないかと仮説を立てる。病理学的状況では、Th17 対 Th1 および Treg バイアスが促進され、IL-17+ Foxp3+ 細胞が生成される可能性があります。 したがって、Treg 誘導細菌の腸内微生物叢を強化することは、SLE 患者にとって望ましい目標となる可能性があります。 しかし、ファーミクテス属/バクテロイデス属の比は健康な対照とSLE患者の間の主な違いを表しているが、観察されたSLE微生物叢に関連するTh17免疫応答に関与する特定の細菌群は、我々のアプローチでは決定できず、さらにファーミクテス門にはTh1747 と Treg23,41,42,43,44 の両方が細菌を誘導します。 したがって、そのような仮説の確認には、無菌マウスを使用した追加の実験や動物モデルでの糞便微生物叢の移植手順が役立つと考えられます。

特定の共生微生物は Treg 誘導能力を示しており、したがって腸粘膜の免疫恒常性を回復するために過剰な炎症反応を調節するのに適した潜在的なプロバイオティクス株として提案されています。 したがって、この研究では、ナイーブTリンパ球をTreg細胞に分化させることができることが知られている株でSLE腸内細菌叢を強化することの考えられる効果を決定することを目的として、インビトロ分析を実施しました。 ファーミクテス門には、クラスター IV および XIVa に属するいくつかのクロストリジウム属が含まれており、Treg 細胞を誘導することが知られています 23、41、42、43。 同様に、ビフィズス菌も大腸炎のマウスモデルを用いて、生体内で Treg 極性化と Th17 減少を促進することが実証されています 48。 したがって、我々は、これらのクロストリジウム菌株のうち 2 つと、機能的な Treg 細胞を生成する in vitro 能力が以前に実証されているビフィズス菌株の混合物を使用しました 23,24。 予想外なことに、どちらもこの個体数を増やすことはできませんでしたが、結果は、各細菌処理ごとに異なる他の有益な効果を示しました。 SLE-Mにクロストリジウムを補給すると、IL-17/IFNγバランスの有意な用量依存性低下が誘導され、Th1バイアスが回復しましたが、ビフィズス菌の濃縮は、CD25発現の低下によって検出されるように、CD4+リンパ球の過剰活性化を防止しました。 しかし、これらの影響は、エフェクター Th 細胞の積極的な抑制の結果である可能性があります。 実際、観察されたTh17細胞の下方制御は、健康なヒト微生物叢の異なる画分が定着した無菌マウスを用いてAtarashiら43が得た結果によれば、クロストリジウム菌株によるTreg細胞の優先的な促進によって説明できる可能性がある。 同様に、ここで使用されるビフィズス菌株で生成された Treg 細胞の抑制機能は、エフェクター細胞上の CD25 発現の下方制御をもたらします 23。 したがって、これらの結果と以前に報告されたSLE腸内細菌叢の異常を考慮すると、SLE患者のTreg/Th17/Th1バランスを回復するために、Treg誘導株を含むプロバイオティクスの補給による治療効果の可能性を考慮するのが合理的であると思われます。

もう一つの注目すべき結果は、ほとんど知られていない腸内細菌である Synergistetes が SLE において果たす役割が示唆されたことである。 この細菌群は、健常対照ではバクテロイデスと負の相関があり、健常対照ではファーミクテス対バクテロイデスの比と正の相関があったが、SLE患者では、炎症誘発性でTh17を促進するサイトカインであるIL-6の血清レベルがSLE患者で増加することと強い負の相関が示された。 さらに、SLE の特徴として、抗 dsDNA 抗体の力価が増加すると、Synergistetes の量が減少する傾向がありました。 これらの発見により、我々は、防御的な体液性免疫応答の発生における腸管シネジステテスの役割の可能性を評価することにつながりました。 共生細菌またはアポトーシス細胞由来のネオアンチゲンに対する天然 IgM 抗体は、出生時からヒトの循環中に一般的に存在しており、保護機能と免疫調節機能を持っています。 中でも、ホスホリルコリン (PC) を認識する IgM 抗体は、アポトーシス細胞の食作用を増加させ、自己免疫およびアテローム性動脈硬化における炎症経路を阻害することが知られている免疫系の貴重な構成要素です 20,22,49。 しかし、抗 PC IgG にはこれらの保護効果はないようです。 我々のSLEコホートの結果から、SLE患者におけるシナジステテスの割合は総IgMおよび抗PC IgMおよびIgM/IgG比と正の相関があるのに対し、血清IL-6レベルは逆の相関を示すことが明らかになった。 これらのデータは、天然 IgM 抗体の生成を促進する腸内共力細胞の保護的役割が示唆されており、これは SLE 患者、特に IL-6 レベルが高い患者では妨げられる可能性があります。 興味深いことに、抗 PC IgM 抗体は、おそらく狼瘡免疫複合体を含む TLR アゴニストに対する MAPK 応答の阻害により、in vitro および in vivo で IL-6 アップレギュレーションに対抗できることが報告されており 22、したがって、これらの天然抗体と免疫複合体との逆の関連性が説明されています。相乗効果とIL-6。 さらに、IL-6 ノックアウトマウスでは B1 細胞と抗 PC 抗体が増加しますが、B2 細胞と IgG レベルではその逆が起こります 51。 これらの結果と一致して、抗dsDNA力価は抗PCレベルと負の相関があり、したがって天然の防御抗体の量に対する疾患活動性の悪影響が裏付けられました。 実際、抗 PC IgM レベルが高いほど、SLE 疾患活動性が低いと関連しています 20。 残念ながら、治療への干渉を避けるため、活動的な患者は腸内細菌叢の研究に含まれていなかったため、SLEDAI スコアと Synergistetes または抗 PC IgM 抗体との間に有意な関連性は検出されませんでした。

天然抗体、特にアテローム保護の役割を持つ抗体の促進におけるシナジステテスの関与は、SLE やその他の自己免疫疾患の患者にとって臨床的関連性がある可能性があります。なぜなら、彼らは通常、早期のアテローム性動脈硬化症を発症し、古典的な要因では説明できない心血管リスクの増加があるからです。 。 SLE 患者における抗 PC IgM 抗体レベルの低下により、無症候性心血管疾患が予測される可能性があることが報告されています 21。 さらに、心血管イベントを患った患者は、残りの患者と比較して、これらの抗体のレベルが著しく低かった 21,49。 実際、抗 PC の受動的伝達に基づく治療は、アテローム性動脈硬化症の発症を抑制するために使用されています 52。 したがって、防御的 IgM 抗体の促進を通じて自然な体液性反応を拡大できる腸内微生物 (Synergistetes など) を同定することは、疾患活動性と心血管合併症の予防の両方を改善するための臨床介入を設計するための貴重なツールとなる可能性があります。 この意味で、心血管イベントの有無にかかわらず、SLE 患者の糞便相乗作用の分析は興味深いはずです。

要約すると、SLE患者から分離された糞便微生物叢を用いたin vitro培養は、腸内細菌に対する免疫応答が、SLE患者で観察されるリンパ球の過剰活性化およびファーミキューテスの減少によるTreg-Th17分化転換に関与している可能性があることを示唆した。おそらく、このプロセスに役割を果たしていると考えられます。 腸内毒素症に関連する免疫応答の変化は、サプレッサー応答を誘導できる有益な細菌株を補給することによって、少なくとも部分的には再確立される可能性がある。 さらに、我々の結果は、天然の防御抗 PC IgM 抗体の発生における腸内協力者が役割を果たしている可能性を明らかにしました。 これは、IL-6 および/または抗 dsDNA レベルが高い患者では、これらの細菌の頻度が低いため、特に関連性がある可能性があります。

ヘルシンキ宣言に従って、この研究の倫理承認は CSIC の生命倫理委員会 (Consejo Superior de Investigaciones Centíficas) および臨床研究地域倫理委員会 (Servicio de Salud del Principado de Asturias) から得られました。 すべての方法は承認されたガイドラインに従って実行され、研究への参加前にすべての参加者から署名されたインフォームドコンセントが収集されました。

ヒト末梢血単核球 (PBMC) は、Ficoll-Hypaque 勾配 (Lymphoprep、Nycomed、オスロ、ノルウェー) で遠心分離することにより、7 人の健康な献血者 (Asturian Blood Transfusion Center、オビエド、スペイン) からの標準バフィーコート調製物から得ました。 単球 (CD14+ ≥ 95%) は、ヒト単球濃縮キット (EasySep、Stem Cell Technologies、カナダ) を使用したネガティブ選択によって、以前に取得した PBMC から単離されました。

未成熟DCは、標準的な手順により単離された単球から得られた。 したがって、単球は、完全 RPMI 培地 (RPMIc) [2 mML グルタミンおよび 25 mM Hepes を含む RPMI 1640 (Bio Whitaker, Verviers、ベルギー)、組換えヒト (rh) IL-4 (35 ng/ml) および rhGM の存在下で、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FCS) および抗生物質ストレプトマイシンおよびアンピシリン 100 mg/ml を添加] -CSF (70 ng/ml) (R&D Systems、アビングドン、英国)。 2日目および5日目に、発生中のDCのクラスターを乱すことなく0.5 mlの培地を除去し、0.5 mlの新たに作製したGM-CSFおよびIL-4含有培地をウェルに添加し、各ウェルの最終体積を回復した。 1mlまで。 7日目に、未成熟DCを回収し、洗浄し、その後の成熟のために5×105細胞/mlでRPMIc培地に再懸濁した。

未熟単球由来のDCを、成熟のポジティブコントロールとして大腸菌0111:B4（Sigma、セントルイス、ミズーリ州）由来の1 mg/ml LPSを含むRPMIc培地で、またはDC:細菌の異なる細菌調製物を用いて培養しました。比率は1:10。 この目的のために、メタゲノミクス研究により両方の状態を代表することが以前に示されている 4 人の健康な対照 (HC-M) または 5 人の SLE 患者 (SLE-M) から分離されたプールされた糞便微生物叢 (M) が調製され、DC で使用されました。文化。 また、SLE-M には、Foxp3 発現を誘導することが知られている菌株であるビフィドバクテリウム ビフィダム LMG13195 (Bb) が異なる割合で濃縮されていました 23,41、または 2 つのクロストリジウム菌株 (Cl: Ruminococcus obeum DSM25238 および Blautia coccoides DSM935、比率 1: 1)、推定上の Treg 誘導効果があります 42,43。 したがって、5、10、または 15% の SLE-M を同じ割合の Bb または Cl で置き換え、DC の刺激に使用しました。 BbおよびCl細菌調製物を用いた培養を対照として実施した。 48 時間後、11 の異なる治療からの DC が収集され、成熟表現型がテストされ、ナイーブ CD4+ T 細胞を刺激するために使用されました。

メーカーの指示に従い、ヒト CD4+ T 細胞濃縮キット (EasySep) を使用したネガティブ選択によって CD4+ T 細胞を PBMC から単離し、CD45RO+ 細胞 (Miltenyi Biotec、ドイツ) を枯渇させた後にナイーブ CD45RA+ T 細胞を分離しました。 LPSまたはさまざまな細菌調製物で成熟した単球由来DCを、DC:T細胞比1:10で48ウェルプレート中で精製CD4+ CD45RA+ T細胞と共培養した。 5 日目と 8 日目に、すべての処理でインキュベートした細胞を IL-2 (30 U) で増殖させました。 12日後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによるTreg/Th17/Th1表現型の分析前に2回洗浄しました。

ビフィドバクテリウム ビフィダム LMG13195 を、0.05% (w/v) L-システイン (Sigma) を補充した de MRS ブロス (Difco、ミシガン州デトロイト) 中で増殖させました。 Ruminococcus obeum DSM25238 および Blautia coccoides DSM935 は、5% (v/v) 熱不活化 FCS (LabClinics、バルセロナ、スペイン）。 培養物は、10% (v/v) H2、10% CO2、および 80% N2 の雰囲気を備えた MG500 嫌気チャンバー (Don Whitley Scientific、英国ウェストヨークシャー) 内で 37 °C で増殖させました。 培養物を遠心分離によって回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、同じ緩衝液に１０ ８ 細菌／ｍｌの濃度まで再懸濁した。 トーマ細胞計数チャンバー（Marienfeld Superior、ドイツ）を使用して細菌を計数した。 細菌細胞を、UV チャンバー (15 W、Selecta、バルセロナ、スペイン) 内で 30 分間の連続 3 サイクルに曝露することにより死滅させました。 適切な培地で回復できる細菌が存在しないことを確認するために、UV 処理後にプレート計数を実行しました。 UV で死滅させた細菌懸濁液をアリコートに分配し、使用するまで -80 °C で保存しました。 菌株の同一性は、プライマー plb16 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') および mlb16 (5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3') を使用して 16 S rRNA 遺伝子の V1 および V2 可変領域を配列決定することによって確認されました53。

以前メタゲノム研究 39 で使用された 4 人の健康な対照者と 5 人の SLE 患者の便サンプルの一部は、Courtois et al. 54 の方法に従って、残りの糞便物質から微生物叢を分離するために密度勾配遠心分離にかけられました。 。 糞便を、ホモジナイザー（Stomacher Lab Blender 400、WVR、バルセロナ、スペイン）中で滅菌NaCl 0.9％（1：9；w/v）中で1分間均質化した。 Nycodenz® 80% (w/v) (PROGEN Biotechnik GmbH、デラウェア州ハイデルベルク) の溶液を超純水で調製し、121 °C で 15 分間滅菌しました。 10.5 ml の均質化した糞便サンプルを 3.5 ml の Nycodenz® 溶液の上に置き、10,000 g で 40 分間、4 °C で遠心分離しました。 可溶性破片を含む上相を廃棄し、不溶性破片を沈殿させるために微生物叢に対応する層を氷中に5分間保持し、PBSで2回洗浄し、同じ緩衝液に分割して保存した。 1 ml、-80 °C で 108 微生物/ml。 前のセクションで説明したように、UV 不活化微生物叢を取得しました。

米国リウマチ学会 (ACR) が改訂した SLE55 分類基準を少なくとも 4 つ満たす 37 人の SLE 患者が、更新されたアストゥリアス ループス登録簿から選択されました 56,57。 病気の経過中の臨床的特徴に関する情報は、臨床病歴を検討することによって得られました（表1）。 36 人の性別と年齢を一致させた健康な献血者を対照として使用しました (平均年齢 ± SD: 42.56 歳 ± 11.39)。 サンプリング時、抗dsDNA力価、SLE疾患活動性指数（SLEDAI）および/または体重、BMI（肥満指数）および血中脂質[トリグリセリド、HDL（高密度リポタンパク質）、LDL（低密度リポタンパク質）]および総コレステロール]が評価され、患者は過去6か月間受けた治療に関して正確な質問をされました。

糞便微生物叢のメタゲノム解析は、過去 6 か月間抗生物質または免疫抑制治療を受けていない非活動性 SLE 患者 20 名と、前述のように年齢が一致した健康な対照 20 名で実施されました 39。 糞便 DNA 抽出、16 S rRNA 遺伝子ベースのアンプリコンの 16 S rRNA 増幅配列決定、および配列ベースの微生物叢解析は、他の場所で報告されています 39。 この記事で報告された生​​の配列は、NCBI Short Read Archive (SRA) (研究アクセッション番号: SRP028162) に保管されています。

培養細胞および血液サンプルの表現型研究は、適切なモノクローナル抗体 (mAb) で染色した後に実行されました。 培養 DC の成熟は、抗 CD86 フルオレセイン イソチオシアネート (FITC)、-CD80 フィコエリトリン (PE)、-HLA-DR PE-Cy5、-CD1a FITC mAb、または対応するアイソタイプで 4 °C で 30 分間染色した後に検証されました。ネガティブコントロールとして、対応する結合型無関係な mAb (すべての mAb は Pharmingen から供給されました)。 培養細胞と血液サンプルの両方で Treg/Th17/Th1 表現型を決定するために [2 ml BD Lysing Solution (BD Biosciences、カリフォルニア州サンディエゴ) で事前に 5 分間溶解し、PBS で 2 回洗浄した]、CD4+ リンパ球を最初に細胞外で染色しました。抗 CD4 アロフィコシアニン -Cy7 (APC-Cy7)、抗 CD25 FITC、および抗 CD127 PE-Cy7 mAb、または対応するアイソタイプが一致した結合型無関係 mAb を使用したもの (すべて eBiosciences、カリフォルニア州サンディエゴ)。 次に、細胞を固定し、透過処理し、抗 FOXP3 PE、IFNγ PerCP-Cy5.5 および IL-17 A APC (Foxp3/転写因子染色バッファーセット; eBiosciences) または対応するアイソタイプが一致した結合型無関係 mAb で細胞内染色しました。メーカーの指示に従ってください。 最低 10,000 個の CD4+ リンパ球を FACSCanto II フローサイトメーター (BD) で取得し、FlowJo ソフトウェア (Tree Star Inc) を使用して分析しました。 特定の蛍光強度は、総蛍光からアイソタイプが一致したコントロール染色のバックグラウンドを差し引くことによって計算された平均蛍光強度 (MFI) として定量化されました。

SLE 患者および HC からの血清サンプルを収集し、サイトカイン測定が行われるまで -80 °C で維持しました。 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17 A、IFNα、VEGF、および GM-CSF の量は、FACS Canto II を使用した Cytometric Bead Arrays Flex Set によって分析されました。フローサイトメーター（BD Biosciences）。 IL-1β、IL-6、IL-10、および IL-12p70 の場合、Enhanced Sensitivity Flex Set が必要でした。 ELISA キットは、メーカーの指示に従って、TNFα、レプチン、レジスチン (Mini EDK キット、PeproTech)、BLyS (Human BAFF Instant ELISA、eBioscience) および IFNγ (OptEIA キット、BD) の定量に使用されました。 検出下限は、IL-1β で 48.4 fg/ml、IL-4 で 1.4 pg/ml、IL-6 で 68.4 fg/ml、IL-8 で 1.2 pg/ml、IL-10 で 13.7 fg/ml でした。 、IL-12p70については12.6 fg/ml、IL-17 Aについては0.3 pg/ml、IFNαについては1.25 pg/ml、VEGFについては4.5 pg/ml、GM-CSFについては0.2 pg/ml、TNFαについては3.9 pg/ml、レプチンについては63 pg/ml、レジスチンについては24 pg/ml、BLySについては130 pg/ml、IFNγについては0.58 pg/ml。

ホスホリルコリンに対する IgG および IgM 抗体 (抗 PC) は、以下のように社内 ELISA 検査によって患者および対照からの血清サンプルで定量されました。 マイクロタイターウェル（Maxisorp、Nunc）をウシ血清アルブミン結合ホスホリルコリン（PC-BSA）（Biosearch Technologies、Petaluma）で一晩コーティングし、PBS 2% BSA で 37 °C で 2 時間ブロックしました。 健康な対照の血清プールを抗PC Ab標準として使用した。 血清サンプルと抗 PC 標準をトリス緩衝生理食塩水 (TBS) で希釈し、室温 (RT) で 2 時間インキュベートしました。 TBS/Tween 20 (0.05%)で洗浄した後、ウェルをアルカリホスファターゼ結合抗ヒトIgGまたはIgM (Immunostep、サラマンカ、スペイン)とともにRTで2時間インキュベートした。 最後に、プレートを２回洗浄し、基質としてｐ－ニトロフェニルホスフェートを使用して暴露した。 吸光度は405nmの波長で測定した。 血清抗PC任意単位の量を、標準曲線に従って各サンプルについて計算した。 同様に、総 IgG または IgM を従来の ELISA 技術によって定量しました。

コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、データの正規分布を評価しました。 インビトロ実験データは平均値±SEMで表し、培養条件間の差異は対応のあるWilcoxon検定で評価した。 SLE患者と健常対照のサイトカイン血清レベルは中央値（四分位範囲）として表され、ノンパラメトリックなマンホイットニーU検定を使用して両群間の差異を決定した。 Treg/Th1/Th17 細胞の割合は、Kruskal-Wallis 検定を使用して比較されました。 有意な検定が得られた場合、ダンの事後検定を実施して、グループのペアにおける統計的差異を決定しました。 糞便微生物グループの頻度と、T 細胞サブセット、サイトカイン血清レベルおよび自己抗体との関連性は、スピアマンの順位相関検定によって検査され、体重、BMI、血中脂質 (トリグリセリド、HDL、LDL、総コレステロール) で調整された多変量線形回帰分析によって確認されました。 Prism 5 ソフトウェア (GraphPad Software、USA) および SPSS 22 統計ソフトウェア パッケージ (SPSS Inc.) をすべての測定に使用し、p 値 < 0.05 を有意であるとみなしました。

この記事を引用する方法: Lopez, P. et al. Th17 応答と天然 IgM 抗体は、全身性エリテマトーデス患者の腸内細菌叢の組成に関連しています。 科学。 議員6、24072; 土井: 10.1038/srep24072 (2016)。

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この研究は、欧州連合の FEDER 基金、Fondo de Investigación Sanitaria (PI12/00523)、スペイン国家研究開発計画 (AGL2010-14952 および AGL2013-44039-R)、およびアストゥリアスおよびテクノロジー応用科学研究促進財団 (EQUIP09) によって支援されました。 -19)。 JR-C。 スペイン教育・文化・スポーツ省からFPU助成金の受給者です。 BJ と AH は、それぞれスペイン経済競争力省からラモン・イ・カハル博士研究員契約と FPI 助成金を受けています。 SLE 患者と ALAS (Asociación Lúpicos de Asturias) の継続的な励ましに感謝します。

オビエド大学医学部免疫学分野機能生物学教室（オビエド、アストゥリアス、スペイン）

パトリシア・ロペス、ベインズ・オブ・ピース、ハビエル・ロドリゲス＝カリオ、アナ・スアレス

アストゥリアス乳製品研究所 (IPLA)、高等科学研究評議会 (CSIC)、乳製品の微生物学および生化学部門、ビジャビシオサ、アストゥリアス、スペイン

バネサ・オブ・ピース、ヘビー・スパイダー、ボルハ・サンチェス、アベラルド・マルゴレス

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PLは、研究の実施、サンプル収集、臨床症状のレビュー、患者の疾患活動性と治療、実験手順、データ分析/解釈、原稿の作成に参加しました。 BPとJR-C。 いくつかの実験手順とデータ分析を実行しました。 BS、AH、AM は微生物叢関連の設計研究、実験、分析に参加しました。 AS は研究の設計/実施、データ解釈、原稿の準備に貢献しました。

アベラルド・マルゴレスへの通信。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ロペス、P.、デ・ピース、B.、ロドリゲス・カリオ、J. 他 Th17 応答と天然 IgM 抗体は、全身性エリテマトーデス患者の腸内細菌叢の組成に関連しています。 Sci Rep 6、24072 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep24072

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受信日: 2015 年 9 月 14 日

受理日: 2016 年 3 月 18 日

公開日: 2016 年 4 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24072

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